第三节 植物生长调节剂的应用实例
一、植物的快繁与脱毒
1．红肉苹果
红肉苹果[Malus sieversiif.neidzwetzkyana（Dieck）Langenf]为蔷薇科苹果属小乔木，原产于中国新疆，春季长出的新叶为紫红色，果皮和果肉全为红色。果肉中富含多种类黄酮，其中对抗癌起重要作用的槲皮素含量要比普通苹果高。苗木繁殖效率低。
培养方法及步骤：
（1）外植体消毒及预培养 在春季芽萌动前1周采集侧芽饱满的当年生茎段，自来水冲洗1h，70%乙醇浸泡1min，10%次氯酸钠（含吐温）表面消毒15min，灭菌去离子水清洗茎段3次，切取带饱满芽的茎段（芽距离上下端各约1～2cm），芽向上斜插入预培养培养基（MS＋0.1g/L 肌醇＋0.1mg/L IBA＋1mg/L 6-BA＋蔗糖＋0.8%琼脂，pH 5.8），每个试管内放置1个茎段。培养条件：4000～6000lx光照，16h/d，25℃室温。
（2）叶盘法诱导不定芽 从预培养萌发的幼芽上选取顶端全展开的4片叶子，切成0.5～1cm2大小的叶盘，生理正面朝下放在培养基上，先暗培养2周，然后光照培养，2周更换1次培养基（MS＋0.1g/L 肌醇＋0.2mg/L IBA＋1.0mg/L TDZ＋蔗糖＋0.8%琼脂，pH 5.8）。再生率为100%，平均每个叶盘再生9.57个不定芽。
（3）材料扩繁 选取高度2cm以上的不定芽，接种于扩增培养基（MS＋0.1g/L 肌醇＋1mg/L IBA＋1mg/L 6-BA＋蔗糖＋0.8%琼脂，pH 5.8），4周扩繁率为8.27。
（4）生根培养 选取3cm以上，生长健壮无根苗接种到生根培养基（MS＋0.1g/L 肌醇＋0.6mg/L IBA3%＋蔗糖＋0.8%琼脂，pH 5.8）。在弱光条件（1000～5000lx）下培养，4周时生根率为93.3%。
2．铁皮石斛
铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Mi-go），为兰科石斛属多年生草本植物，具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖、提高免疫力等诸多功效。铁皮石斛对生长环境要求苛刻，自然条件下繁殖率极低，种子不易萌发，生长缓慢，市场供不应求。由于过度采挖及生境恶化，铁皮石斛野生资源日趋稀少。
（1）种子快繁技术
① 外植体消毒及预培养 挑选饱满、未开裂的蒴果，流水冲洗15min，双蒸水冲洗3～5次。在超净工作台上将蒴果用75%乙醇冲洗3次，酒精棉球擦拭果实表面，无菌水冲洗2～3次，0.1%升汞浸泡2～5min，无菌水漂洗5次，于酒精灯上灼烧数秒后用灭菌解剖刀切开口。
② 种子萌发培养 将种子接种于培养基1/2MS上，暗处培养3d，再转入光下进行培养，30d后种子平均萌发率为90%。
③ 原球茎增殖培养 选取直径大小在0.5～1.0cm，颜色淡绿色、没有玻璃化的团状原球茎，接种到原球茎增殖培养基（MS＋0.2mg/L NAA＋0.5mg/L 6-BA），35d增殖率为120%。
④ 芽增殖培养 将原球茎接入芽增殖培养基（MS＋2.0mg/L 6-BA＋0.25mg/L NAA＋20%马铃薯提取液），植株健壮，叶片呈深绿色，且生出了根，35d时其再生率高。
⑤ 生根培养 将丛生芽接种到生根培养基（MS＋0.2mg/L NAA＋20%马铃薯提取液），35d平均根长1.9cm。
所有培养基的pH6.0左右，培养条件为温度（25 ± 2）℃、光照强度 1500～2000lx、湿度 60%～75%、光照12h/d。
（2）茎段快繁技术
① 外植体消毒及初代培养 在无菌条件下将冲洗干净的茎段用75%乙醇消毒20s后，无菌水冲洗1次，0.1%升汞灭菌10min，无菌水冲洗3～5次，切成带1个节的1cm茎段。
② 丛生芽诱导培养 消毒过的小茎段接种于诱导培养基（MS＋1.5-2.0mg/L 6-BA＋0.2mg/L NAA＋10%椰子汁），腋芽萌动早，生长快，40d时诱导丛生芽多，50d时丛生芽高0.5～1.5cm。转接2～3次，不同铁皮石斛生理小种丛生芽诱导率在7.8%～30.8%之间。
③ 继代增殖培养 将分化的丛生芽转接到增殖培养基（MS＋0.5mg/L 6-BA＋0.2mg/L NAA＋10%椰子汁）。40d时不同铁皮石斛生理小种增殖倍数在3～5之间，芽生长正常。
④ 壮苗生根培养 将高1.0～3.0cm丛生芽接种到生根培养基（1/2MS＋0.5mg/L NAA＋0.2mg/L IBA＋10%香蕉泥），生根率在95%以上，根个数在4.2～5.2个之间。
⑤ 炼苗移栽 铁皮石斛生根瓶苗或袋苗在自然光下炼苗2个月，移栽于松树皮上，2个月后成活率在90%以上。
所有培养基均附加30.0g/L蔗糖、琼脂4.0g/L，pH5.8。培养条件：温度25～28℃，光照强度 1500～2000lx，光照9h/d。
3．草莓
草莓（Fragaria ananassa Ducde）是蔷薇科草莓属宿根性多年生常绿草本植物。草莓成熟果实鲜红艳丽，柔软多汁，香味浓郁，酸甜可口，营养丰富，深受国内外消费者的欢迎。草莓在我国多数地区广泛栽培。有些栽培品种品质差、产量低，在种植老区出现病害日趋严重，尤其是病毒的侵染，导致植株长势差、产量低、品质劣。
方法一：茎尖脱毒培养
（1）外植体消毒及茎尖培养 先将草莓“丰香”匍匐茎放在40℃热水中处理4h，选取匍匐茎顶端约3～4cm长的顶芽，自来水冲洗2～3h，在超净台上摘除匍匐茎外部大叶，用70%酒精浸泡30s，饱和漂白精浸泡15min，然后用无菌水冲洗3～5遍。在双筒解剖镜下由外向内逐层剥去幼叶，直至闪亮半圆球的顶端分生组织充分暴露出来，切取0.5mm左右大小茎尖接种于培养基（MS＋0.5mg/L 6-BA）。茎尖成活率47.37%，脱毒效果良好。
（2）快速繁殖 将分化的组培苗转接到增殖培养基（MS＋0.5mg/L 6-BA），增殖培养过程中40d或更长时间继代1次，其增殖系数为6。
① 试管苗生根 经过几代增殖培养后，将生长健壮的组培苗转接到生根培养基上，培养20d左右，生根率达100%，平均生根6条/株，根长4～5cm。
② 试管苗驯化 生根培养20d后，将生根试管苗瓶口打开，培养室内放置2～3d，取出后洗净其根部的培养基（1/2MS），生根苗移栽到全蛭石的基质上驯化，成活率高于98%。
培养基均含有3%蔗糖、0.8%琼脂，pH5.6。光照强度31.25μmol/（m2·s），温度（25±2）℃。
方法二：叶片培养
（1）外植体消毒及预处理 从田间取草莓“鬼露甘”15～20d在左右叶龄的叶片，用自来水冲洗30～60min，75%酒精中浸泡40s，无菌水冲洗3～5次，0.1%升汞溶液中轻摇4min，用无菌水冲洗3～5次，用无菌滤纸吸干水分。
（2）不定芽诱导 叶片进行四周刻伤，其远轴端接触不定芽诱导培养基（MS＋2.0mg/L 6-BA＋0.1mg/L IBA），先进行7d的暗培养，防止外植体的褐化。叶龄在15～20d时，叶片再生能力最强，叶片再生频率最高，可达60%以上。当叶龄超过40d，再生率低于10%。
（3）不定芽伸长 将再生的不定芽从基部切下，转移到不定芽伸长培养基（MS＋0.5mg/L 6-BA＋0.5mg/L IBA）。一般单生芽都能伸长直至成苗，分不开的丛生芽会有1～2个健壮的小芽经伸长培养后能够发育成植株，其他的发育不良或枯萎死亡。
（4）不定芽生根 待不定芽长到3cm左右，从茎基部分切下接种到生根培养基（MS＋0.2mg/L IBA），诱导无菌苗发根，获得完整植株，生根率达100%，试管苗移栽成活率87%。
上述培养基均含有3%蔗糖、6g/L琼脂，pH5.8。121℃高压灭菌20 min。培养条件：光照强度1500～2000lx，光/暗周期16h/8h，温度（25±2）℃。
4．马铃薯
马铃薯（Solanum tuberousm L．）是双子叶植物，属茄科（Solanaceae）茄属（Solanum）一年生草本植物。马铃薯生育期短，产量高，营养丰富，是典型的粮菜两用型作物，是世界重要栽培作物之一，主要分布在欧洲和亚洲。我国是世界上最大的马铃薯生产国。马铃薯在种植过程中感染病毒而引起退化，直接影响了马铃薯的品质及产量，严重阻碍了马铃薯的生产和利用。应用植物组织培养方法特别是茎尖组织培养来获取脱毒苗，已成为当前解决马铃薯品种退化的主要技术。
方法一：茎尖脱毒培养
培养方法及步骤如下：
（1）外植体预处理及茎尖培养 马铃薯品种陇薯6号块茎出芽后，将芽用自来水冲洗2h，在超净工作台上用75%酒精浸30s，0.1%升汞浸泡8～10min，然后无菌水冲洗3～4遍，接种到快繁培养基上。待成苗后在40×解剖镜下剥取带两个叶原基的茎尖，接种到快繁培养基（MS＋0.5g/L 6-BA＋0.1mg/L GA3＋0.1mg/L NAA＋0.05%活性炭）中，成活率可达80%，成苗率70%，经检测可获得11.17%的去毒株。
（2）切繁培养 待单芽分化出两片可见叶、茎明显伸长时，转入无植物生长调节剂的MS培养基上培养，苗高4～5cm时开始切繁。
以上培养基均加3%白糖和0.65%卡拉胶，培养室通过自然光培养。
方法二：花药培养
培养方法及步骤如下：
（1）材料处理及花药愈伤组织诱导 选取小孢子发育在单核靠边期至双核早期的花蕾，花蕾经低温（4℃）处理24～48h，用0.1% HgCl2消毒10min，无菌水冲洗4～5次，在无菌条件下取出花药接种在花药愈伤组织诱导培养基（MS＋0.5mg/L NAA＋0.5mg/L 2，4-D＋0.5mg/L KT），黑暗培养。观察发现在相同的培养条件下不同基因型材料的愈伤组织的诱导频率有较大的差异。蔗糖浓度提高到6%时，愈伤组织诱导率最高。
（2）愈伤组织的分化 30d后将愈伤组织转移到分化培养基（MS＋0.2mg/L NAA＋2.0mg/L 6-BA＋1.0mg/L ZT），每隔20d继代1次。分化培养条件：16h/d，光照强度 2000lx，培养温度25℃。在分化了根的愈伤组织中能分化出绿苗，炼苗移栽后的双单倍体植株生长势、叶色、薯型等性状与对照相比存在差异。
5．香蕉
香蕉属于芭蕉科（Musaceae）芭蕉属（Musa），是世界著名的热带、亚热带水果，其具有丰富的营养价值，依照其用途通常将香蕉作物分为香蕉（banana）和粮蕉。目前栽培的香蕉品种主要是三倍体，遗传背景复杂，高度不育和单性结实，因此无性繁殖是香蕉的主要繁殖方式。
（1）外植体消毒及腋芽启动培养 “金手指”（Goldenfinger）香蕉，选取生长健壮、无病害植株40～50cm高的吸芽为外植体，用自来水冲洗，切除上部的外假茎，留下6cm高的茎和下部外假茎。在无菌条件下逐层剥去包在茎外的叶鞘，直至外植体大小为2cm×2cm×2cm，70%酒精浸泡15s，0.1%升汞溶液消毒2次，每次5min，无菌水冲洗4～5次，将处理后的外植体纵切一分为二接种到腋芽启动培养基（MS＋6 BA 6.0mg/L＋IBA 0.5mg/L）中培养。25d左右茎节处有不定芽生成，不定芽数量平均可达3.5个。
（2）丛生芽增殖培养 将腋芽切下在丛生芽增殖培养基上培养。丛生芽增殖培养初期采用增殖培养基1（MS＋6 BA 6.0mg/L＋IBA 0.5mg/L）；多次增殖培养后应采用增殖培养基2（MS＋6-BA 4.0mg/L＋IBA 0.2mg/L）；5次增殖培养后，增殖速度可以达到2.5～3.0倍。
（3）壮苗生根培养 继代到10～12代时进行壮苗和生根培养。将2～3cm长的生长正常的丛生芽切成单芽后转入生根培养基（MS＋IBA 1.0mg/L＋NAA 0.2mg/L），培养7d左右100%生根，生长快。
（4）炼苗和移栽 当根系长出后进行炼苗培养，30d左右出瓶移栽，成活率可达95%以上，移栽后需注意浇水。
以上培养基均含蔗糖 30g/L、琼脂6.7g/L，pH5.5～5.8。培养温度（28±2）℃，光照强度1500～2000lx，光照时间12h/d。
6．白芨
白芨[Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.]为兰科（Orchidaceae）白芨属（Bletilla）多年生草本植物，花艳丽，地下茎肥厚，是常用的中药材。目前，白芨的采集主要以野生自然资源为主，随着白芨的价值日渐提升，野生资源不能满足市场需求。白芨蒴果内含种子数万粒，但在自然条件下不易发芽，其繁殖方式是以分株繁殖为主，但繁殖系数较低，难以满足大规模生产的需要，而且分株繁殖方法，发生病毒很难去除。
（1）外植体消毒及种子萌发培养 选取4个月的果荚，用75%乙醇浸泡3min后，置于10%次氯酸钠溶液中消毒20min，再用无菌水冲洗4～5次后，十字状切开果实。用接种针或镊子在解剖镜下将白色粉末状胚接种到种子萌发培养基（1/2MS＋10%椰子汁），并转瓶培养成苗。萌发率可达93%，成苗率95%。
（2）丛生芽诱导 将试管苗的茎尖切下接种到丛生芽诱导培养基（MS＋0.5g/L 6-BA＋0.2mg/L NNA）可诱导丛生芽的发生。
（3）生根诱导 将丛生芽分离为分生苗转移至生根培养基（MS＋0.5g/L NAA＋10% 香蕉汁），转瓶后30～40d均能形成根。在此培养基中加入10%香蕉汁能促进小苗生根并有壮苗作用。
（4）试管苗移栽 将有根试管苗在室温下炼苗3～5d，再打开瓶塞炼苗2～3d，洗去培养基，晾干后移植于透水良好的碎砖、蕨根、碎炭、粗椰糠混合基质中，置于阴凉处，保持较高的空气湿度和适当通风，成活率均可达90%以上。试管苗在种植3～4年后可作为药材收购。
所有培养基用0.7%琼脂固化，pH5.5～5.8、培养温度（25±2）℃，每日光照10～12h，光照强度1600～2000lx。
7．蓝莓
蓝莓（Vaccinium spp.）是杜鹃花科（Ericaceae）越橘亚科（Vaccinioideae）越橘属小浆果灌木。花青素含量高，具有低糖、低脂肪和强抗氧化性的特点，是延缓人体机能衰退的天然功能性水果。扦插繁殖受到季节的限制，并且生根缓慢，生根率不高，繁殖速度慢。培养方法及步骤：
（1）外植体消毒及预处理 剪取蓝莓“顶峰”健壮优株萌发的新枝条作为外植体。去除枝条上的叶片，保留腋芽，将枝条剪切成长约2cm的茎段，用自来水冲洗干净，在超净工作台上用75%乙醇浸泡30s，再用0.1% HgCl2浸泡2～3min，无菌水冲洗5～6次，无菌滤纸吸干水分。
（2）腋芽的诱导 将消毒处理过的茎段接种于腋芽诱导培养基（WPM＋0.5mg/L ZT），1个月时芽诱导率80%。
（3）继代培养 将以上培养获得的无菌植株切成约2cm的茎段，接种于继代培养基（WPM＋ 1.0mg/L ZT）。30d时平均株高6.6cm，增殖系数13.5。
（4）生根培养 取高约3～5cm的无菌苗转移到生根培养基中，2个月培养诱导出不定根系，试管苗生长健壮，叶色浓绿。
（5）试管苗的移栽 当试管苗长到4～7cm时即可出瓶移栽，将瓶盖打开，炼苗3d后取出试管苗，用清水冲洗根部培养基，栽入泥炭土中，浇透水，环境温度22～25℃，湿度80%～90%，60d后移栽成活率80%。
以上培养基均加3%的蔗糖和0.6%的琼脂（生根培养基中用河沙代替琼脂），pH 5.2。培养温度（25±2）℃，光照强度1500～2000lx，光照时间12h/d。
8．百合
百合（Lilium spp.）是百合科（Liliaceae）百合属（Lilium）多年生草本球根植物的统称，种类丰富。全世界百合属植物100多种，其中中国产55种。百合用途广泛，既是名花，又为良药，很多还可以食用。百合的珠芽繁殖、小子球繁殖和鳞片繁殖的系数较低，长期的无性营养繁殖易感染病毒。
培养方法及步骤如下：
（1）外植体消毒 取绿花百合健康植株的地下鳞茎作为外植体，洗去污物，5%洗衣粉溶液漂洗10min，再用清水冲洗干净，然后置于超净工作台内进行消毒灭菌。先用75%乙醇浸泡10s，再转入0.1%升汞溶液中浸泡10min，无菌水冲洗6～8次，每次不低于2min，备用。
（2）胚性愈伤组织和小鳞茎的诱导 将消毒好的鳞片切成约0.8cm×0.8cm方块接种于胚性愈伤组织和小鳞茎诱导培养基（MS＋6-BA 0.5mg/L＋NAA 0.5mg/L＋2，4-D 0.1mg/L），培养35d后出愈率达89.29%，小鳞茎发生系数4.7。
（3）增殖培养 将胚性愈伤组织切成小块，接种于增殖培养基（MS＋6-BA 1.0mg/L＋2，4-D 0.1mg/L），培养35d后繁殖倍数5.0。
（4）生根培养 选取生长健壮高3～4cm的小植株接入生根培养基（1/2MS＋NAA 0.2mg/L）中，培养35d后生根率为100%，且根系粗壮多根毛，幼苗移栽成活率达90%以上
以上培养基均加3%蔗糖和0.45%琼脂，pH 5.8～6.0。培养室温度控制在（20±1）℃，光照强度1500～2000lx，光照时间12h/d。
9．红掌
红掌（Anthurium andraeanum）别称花烛、安祖花，是天南星科花烛属多年生常绿草本植物，在世界各地广泛栽培。红掌主要用于切花和盆栽，具有极高的观赏价值、经济价值。红掌常规采用种子繁殖和分株繁殖，繁殖率低，难以满足市场需求。
培养方法及步骤如下：
（1）外植体消毒及预培养 将红掌品种“红国王”幼嫩叶片、叶柄放在盛有洗洁精溶液的烧杯中摇10min，用自来水冲洗5～6次，除去洗洁精液和表面污物；接着在无菌条件下，用75%乙醇消毒30s；再用0.1% HgCl2消毒5～8min，倒去HgCl2溶液，用无菌水冲洗5～6次。
（2）愈伤组织诱导 将消毒后的叶片切成1cm×1cm小块，叶柄切成长约1cm的茎段，接种到愈伤组织诱导培养基[MS（1/2NH4NO3）＋6-BA 1.0mg/L＋2，4-D 0.4mg/L]。光照时间12h/d，光照强度1000～1500lx，培养30d，叶片愈伤组织诱导率86.21%，茎段愈伤组织诱导率为76.67%。
（3）诱导芽分化 将诱导出的愈伤组织接种至芽分化培养基[MS（1/2NH4NO3）＋6-BA 1.0mg/L＋KT.5mg/L＋CH 100mg/L]上进行培养，光照时间12h/d，光照强度1000～2000lx；光照时间14h/d，光照强度1500～3000lx，不定芽分化率高85%。
（4）芽增殖培养 将诱导获得的无菌芽切下转至芽增殖培养基（MS＋6-BA 0.2～0.8mg/L），增殖系数在3.5以上。
（5）生根培养 将高2cm以上芽由丛生芽上单个切下，转至生根培养基（1/2MS＋NAA 0.5mg/L），生根光照时间14h/d，光照强度2000～3000lx。30d生根率达到93.05%，平均出根数为4～6条。
（6）移栽 将高约4cm、根系发达的健壮幼苗移栽至装有消毒基质的穴盘中，pH调至5.8左右，30d移栽成活率95%以上。
以上培养基均加3%蔗糖和0.7%琼脂，pH 5.8。培养条件：温度（25±2）℃。
10．矾根
矾根（Heuchera micrantha）又称为珊瑚铃，虎耳草科（Saxifragaceae）矾根属多年生耐寒草本花卉，原产于美洲中部。由于其具有彩叶、耐寒、耐阴的优良品质，是北方地区布置阴生环境的优良宿根花卉。品种繁多，部分品种可以播种繁殖，有些品种采用无性繁殖。
培养方法及步骤如下：
（1）外植体消毒 将矾根品种Obsidian截成1.0～1.5cm的带顶芽或腋芽的茎段，用洗衣粉仔细清洗，并在流水下冲洗1h，用无菌水冲洗2次，75%乙醇洗涤30s，无菌水冲洗2次，2%次氯酸钠溶液浸泡12min，最后用无菌水冲洗5次，滤纸吸取外植体表面水分，备用。
（2）诱导培养 灭菌的外植体接种于诱导培养基（MS＋3mg/L 6-BA＋0.2mg/L NAA），14d左右出芽，生长速度快，发育正常，诱导率达92%。
（3）增殖培养基 将诱导的芽接种于增殖培养基（MS＋1mg/L 6-BA＋0.1mg/L NAA），30d生长的茎段伸长可达2.55倍，增殖系数达8.6倍，不定芽生长和分化速度较快，发育正常，茎段粗壮。
（4）生根和炼苗 在1/2MS培养基上培养30d，生根率100%，根色洁白，主根坚韧，须根多，根长可达2～5cm。经炼苗移栽2个月，主根明显增粗，须根数略增长，成活率90%以上。
以上培养基均加3%蔗糖和0.8%琼脂，pH 5.8。培养条件：（23±1）℃，光照14h/d，光照强度4000lx。
11．欧洲甜樱桃
欧洲甜樱桃（Cerasus avium）为蔷薇科（Rosaceae）李亚科樱属植物，原产欧洲黑海沿岸及西亚地区。有“春果第一枝”的美称。其果实成熟早，色泽艳丽，营养丰富，外观和内在品质俱佳，具有便于加工、适宜生食、经济效益高等特点。
培养方法及步骤如下：
（1）外植体消毒 每年6～7月间剪取欧洲甜樱桃“红灯”植株的幼嫩枝条，剪去叶片后用流水冲洗5～6h，用皂液刷净表面，剥去顶芽和腋芽外部的鳞片，露出2～5mm大小的芽尖；切取茎尖、腋芽或带腋芽的茎段，将其置于含有40mg/L维生素C的无菌水中浸泡数分钟，再用70%乙醇表面灭菌1min、0.1% HgCl2溶液振荡浸泡10min，无菌水冲洗5次，备用。
（2）初代培养 芽体在初代培养基（MS＋0.8g/L 6-BA＋0.02mg/L NAA＋0.5mg/L AC）上培养约10d开始萌动，迅速展叶，长势良好，萌发率可高达90%。
（3）继代培养 剪取高约2cm的无菌苗，转接到继代培养基（MS＋0.6g/L 6-BA＋0.02mg/L NAA＋0.1mg/L GA3＋40mg/L VC），培养25d，组培苗继代增殖系数3.0左右，成苗率92.5%。
（4）生根培养 选取在继代培养基上高3～4cm、长势良好的无菌苗，转接至生根培养基（1/2MS＋0.8mg/L NAA）上培养，20d生根率达到100%，根个数为3～4条，根系健壮，叶片充分舒展。移栽成活率86.7%。
以上培养基均加0.7%的琼脂，pH 5.8，初代培养和继代培养添加蔗糖3%，生根培养添加蔗糖1.5%。培养条件：温度（25±1）℃，光照强度80μmol/（m2·s），光照时间15h/d。
12．蝴蝶兰
蝴蝶兰（Phalaenopsis spp.）为热带兰中的珍品，被誉为“洋兰皇后”。蝴蝶兰是单茎性气生兰，植株极少发育侧枝，且种子极难萌发，实生苗变异严重。
培养方法及步骤如下：
（1）外植体消毒 取蝴蝶兰“V31”带有腋芽的花梗，冲洗干净，腋芽两端各保留0.5～0.8cm，用70%乙醇处理25s、0.2% HgCl2处理11 min。将灭菌后的花梗腋芽的包叶除去，芽下端斜切，芽上端平切，备用。
（2）丛生芽诱导 将处理好的外植体插入培养基（MS＋8.0g/L 6-BA＋2.0mg/L NAA＋15g/L椰子粉）中，芽点距离培养基约0.5cm。培养50d，平均出芽数2.60，平均分化时间6.2d，分化率84.57%。
（3）增殖培养 当无菌苗长至2.0cm左右，取大小一致的无菌芽苗，接入增殖培养基（MS＋10g/L 6-BA＋0.6mg/L NAA＋0.2mg/L 2，4-D＋15g/L椰子粉），培养60d，平均增殖倍数7.94。
（4）生根培养 芽增殖培养基（1/2MS＋1.0g/L 6-BA＋0.1mg/L NAA＋20g/L 蔗糖＋10g/L 香蕉粉）中培养30d左右，选取健壮的组培苗接入生根培养基。培养45d，生根率达到100%，平均生根时间11.77d，平均生根数9.47个。
以上培养基均加0.8%琼脂，pH 5.7，丛生芽诱导和增殖培养添加3%蔗糖，生根培养添加2%蔗糖。培养条件：温度（26±2）℃，光照时间12h/d，光照强度27～36μmol/（m2·s）。
13．金线兰
金线兰（Anoectochilus roxburghii）为兰科开唇兰属多年生草本植物，又名金线莲。可全草入药，是我国传统中药材。金线兰的种子小，种胚发育不全，在野生自然条件下萌发率和繁殖率都极低，难以大量繁殖。
培养方法及步骤如下：
（1）外植体消毒 选取生长健壮金线兰茎尖和茎段，冲洗干净，置于加入少量洗涤剂的溶液中，用软毛刷轻轻刷洗，再用流水冲洗1h左右。用75%乙醇消毒30s，转入0.1% HgCl2中消毒8min，用无菌水漂洗5次，吸干水分备用。
（2）丛生芽诱导培养 将金线兰茎尖和带节茎段切成1cm，接种于丛生芽诱导培养基（MS＋1mg/L 6-BA＋1mg/L NAA）。茎尖和带节茎段均能诱导出丛生芽，但带节茎段丛生芽诱导率高于茎尖，且带节茎段最多可产生6～8个新芽。
（3）继代培养 选取生长健壮的丛生芽，将其切分为2～3株一丛，接种于培养基（MS＋1mg/L IBA＋3mg/L 6-BA）中进行丛生芽增殖培养，增殖系数5.2。
（4）生根培养 当丛生芽长至3～5cm时，将其切为单株小苗转接于生根培养基（1/2MS＋0.5mg/L IBA＋0.5mg/L NAA）。生根率84.6%，平均根数2.45。健壮植株移栽60d统计成活率为90%。
以上培养基均加3%蔗糖和0.62%琼脂，pH 5.8。培养条件：（25±2）℃，光照强度2000lx，光照时间12h/d。
14．多肉植物
多肉植物也称为多浆植物、肉质植物，在园艺上有时称多肉花卉。多肉植物是指植物营养器官的某一部分，如茎或叶或根（少数种类兼有两部分）具有发达的薄壁组织用以储藏水分，且在外形上显得肥厚多汁的一类植物。多肉植物品种现已达12000多种，隶属80多科，近800属。目前，多肉植物育性较差，大多采用扦插、嫁接和分株等繁殖方法，繁殖系数较低，且繁殖周期长，难以满足生产需要。利用植物组培技术，可以发挥多肉植物的快速繁殖、丰富品种的作用。下面以多肉植物“劳尔”为例，其培养方法及步骤见下：
（1）外植体消毒 选取多肉植物劳尔（Sedum clavatum L．）的叶片，先用自来水冲洗5min，然后在超净工作台上用75%乙醇消毒30s，再用0.1% HgCl2消毒7min，最后用无菌蒸馏水冲洗3～5次，用无菌滤纸吸干多余水分，备用。
（2）愈伤组织诱导 将消毒好的叶片接种于愈伤组织诱导培养基（MS＋3mg/L 6-BA＋0.1mg/L NAA＋1mg/L KT）。培养60d，愈伤组织诱导率95.7%，叶片膨胀形成球状愈伤组织，增殖速度较快，愈伤组织呈深绿色。
（3）不定芽诱导培养 将愈伤组织接种至不定芽诱导培养基（3/4MS＋3mg/L 6-BA＋0.3mg/L NAA），培养45d，不定芽分化率80.0%，每个愈伤组织块可形成多个芽，且新芽健壮，生长旺盛。
（4）生根培养 将分化出的新芽切下，接种至生根培养基（1/2MS＋0.03mg/L NAA），30d时生根率94.89%，根多且粗长。经炼苗后移栽，基质采用珍珠岩∶蛭石（1∶2），成活率为90%。
以上培养基均加3%蔗糖和0.9%琼脂，pH 6.2～6.4。培养条件：24～26℃，8h/d，光照强度18μmol/（m2·s）。
15．风铃玉
风铃玉（Ophthalmophyllum friedrichiae），番杏科风铃玉属多肉植物。风铃玉植株小巧玲珑，花朵洁白素雅，是小型多肉植物中的珍品，但栽培较为困难。
培养方法及步骤如下：
（1）外植体消毒 选取风铃玉叶片，在超净工作台上用70%乙醇浸泡30s，无菌水冲洗1次，再用0.1% HgCl2消毒10min，无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干表面水分，备用。
（2）愈伤组织诱导 将消毒好的叶片切割成1.0cm×0.5cm大小的片状，接种于愈伤组织诱导培养基（MS＋0.2mg/L 6-BA＋0.2mg/L NAA），愈伤组织诱导率85.7%，愈伤组织呈现淡黄色颗粒状，质地松散。
（3）不定芽诱导培养 将生长旺盛的叶片愈伤组织切成约4mm×4mm大小的块状，接种于不定芽诱导培养基（MS＋0.2mg/L 6-BA＋0.02mg/L IBA）。培养30d，每块愈伤组织有11个不定芽，平均芽高1.1cm。
（4）生根培养 选择生长健壮、长势一致的无菌苗，转接于生根培养基（1/2MS＋0.1mg/L IBA）。21d时生根率83.3%，平均生根数2.7条。
以上培养基均加0.7%琼脂，pH 5.8，愈伤组织诱导和不定芽诱导添加3%蔗糖，生根培养添加2%蔗糖。培养条件：（25±2）℃，14h/d，光照强度18μmol/（m2·s）。
16．非洲菊
非洲菊（Gerbera jamesonii）是异花授粉植物，自交不亲和，自然条件下种子萌发力低，且种子繁殖后代性状容易发生变异，失去原有种性，如花型变小、花梗变细等。非洲菊传统采用种子繁殖、分株繁殖和扦插繁殖等。对具有优良品种特性的非洲菊采用植物组织培养法进行快速繁殖，能够在短期内生产出整齐均匀的大量健壮种苗。
培养方法及步骤如下：
（1）外植体消毒 取非洲菊带3cm花梗的未展开花蕾，用洗涤剂溶液浸泡10min，在流水下冲洗干净。在超净工作台上用70%乙醇浸泡30s，再用0.1% HgCl2溶液浸泡8min，无菌水冲洗3～5次，备用。
（2）愈伤组织及不定芽诱导 将消毒好的花蕾用解剖刀纵向切开，挑出花托，并对切成1/4片花托，接种到诱导培养基（MS＋6mg/L 6-BA＋0.3mg/L IAA）上。外植体接种后3～4d切口膨大，6～7d后长出愈伤组织，愈伤组织呈现青绿色，并伴随一定程度的褐化。20d左右开始分化出带3～4片真叶的芽。
（3）增殖培养 将高3cm以上的芽切下，转接到增殖培养基（MS＋0.5mg/L 6-BA＋0.1mg/L NAA），增殖系数13。
（4）生根培养 将高度3～4cm的丛生芽切成单株，转接到生根培养基（1/2MS＋0.5mg/L IBA＋0.05mg/L NAA），培养15d，植株基部形成少量愈伤组织，生根率98%，根系长势较好。
（5）炼苗及移栽 待苗长出4～5 条根，平均根长2～3cm时，经炼苗后移栽到栽培基质上，15d后，成活率 97.1%，苗长势较好。
以上培养基均加0.7%卡拉胶，pH 5.8，愈伤组织诱导及丛生芽增殖添加3%蔗糖，生根培养添加1.5%蔗糖。培养条件：（25±2）℃，光照14h/d，光照强度1500～2000lx。
17．黑果枸杞
黑果枸杞（Lycium ruthenicum）是茄科（Solanceae）枸杞属多年生落叶植物，常生于盐碱荒地、盐化沙地等各种盐渍化土壤或荒漠环境，具有防风固沙作用，是我国荒漠地区特有的野生植物。黑果枸杞是迄今为止发现的原花青素含量最高的天然野生植物，远超蓝莓等植物。
培养方法及步骤如下：
（1）外植体消毒及种子萌发 将黑果枸杞种子用0.1% HgCl2消毒7～8min，无菌水冲洗3～5次，置于无菌水中浸泡3～4h，然后接种于种子萌发培养基（MS）。约8d后，幼苗萌发。
（2）愈伤组织诱导 将无菌苗的下胚轴切成0.5cm的小段，接入愈伤组织诱导培养基（MS＋1mg/L 6-BA＋0.5mg/L NAA）。15d形成愈伤组织，愈伤组织诱导率100%。
（3）丛生芽诱导 将愈伤组织接种于丛生芽分化培养基（MS＋0.5mg/L 6-BA＋0.5mg/L NAA），培养35d后开始形成芽，增殖系数为7.73。
（4）生根培养 当丛生芽长至2～3cm长时，将其从基部切下插入生根培养基（1/2MS＋1mg/L IBA），45d开始生根，生根率90%。炼苗之后移栽，成活率达90%。
以上培养基均加3%蔗糖和0.225%植物凝胶，pH 5.8。培养条件：光照强度2000lx，光照时间12h/d，种子萌发温度（25±2）℃，其他培养温度为23～25℃。
18．番木瓜
番木瓜（Carica papaya）是番木瓜科（Caricaceae）番木瓜属多年生常绿大型草本植物，营养丰富，为药食兼用的果蔬植物。由于有雄株、雌株和两性株3种株型，用常规种子繁殖不能保证株型一致；而采用扦插、嫁接等常规无性繁殖方法成活率低，易感染病毒。利用植物组培技术繁殖种苗是优质番木瓜规模化生产的最有效的方法，其培养方法及步骤如下：
（1）外植体消毒 选取新鲜、成熟番木瓜果实，先用洗衣粉进行表面清洗，然后流水冲洗1h；接着转至超净工作台用70%乙醇擦拭表面进行初步消毒；最后用经消毒的刀将其剖开，取出种子，小心将表面透明包衣去除，获得番木瓜种子。种子浸泡于1.0mg/L 6-BA与1.0g/L GA3等体积混合液中18h后，接种至种子萌发培养基（1/2MS）。种子发芽率高达93.3%，接种培养后污染率低至3.3%。
（2）芽诱导培养 无菌苗长至4～5节后，切成至少含两个节的带节茎段，平放至芽诱导培养基（MS＋0.5mg/L 6-BA＋0.2mg/L NAA）。培养30d，芽数较多，基部有少量愈伤组织，在后续培养中切除愈伤组织对生长无影响。
（3）增殖壮苗培养 丛生芽长出后，将丛生芽切下，分成均匀的含有2～3个不定芽的小簇，接种到增殖培养基（MS＋0.2mg/L 6-BA＋0.1mg/L NAA＋40.0g/L蔗糖），增殖系数最高4.3。
（4）生根培养 选取经增殖的健壮不定芽，小心切除附于上面的愈伤组织，切成长2～3cm、带2～3片叶子的茎段，接种到生根培养基（MS＋1.0mg/L IBA＋0.05mg/L KT＋2.0g/L AC）。7d左右开始在芽基部出现突起的根原基，14d开始出现细小的根，继而根系增多，生根率达80.0%。
以上培养基均加0.7%卡拉胶，pH 5.8；增殖壮苗培养基添加4%蔗糖，其他培养基添加3%蔗糖。
19．互叶白千层
互叶白千层（Melaleuca altennifolia）属桃金娘科白千层属常绿灌木至小乔木，是从澳大利亚成功引进的高经济价值的芳香植物，其新鲜枝叶和树干提取的精油，俗称“茶树油”。培养方法及步骤：
（1）外植体消毒 选取高精油互叶白千层优良单株，取当年生的幼态萌条，将其剪成5～6cm长的茎段，用75%乙醇浸泡30～60s，0.1%升汞溶液中振荡消毒8～15min，无菌水冲洗5次以上，最后剪切成长1.5～2.0cm的茎段作为外植体。
（2）茎段诱导培养 外植体接种于培养基（MS＋1.0mg/L 6-BA＋0.05mg/L NAA）上，可获得较高的诱导率。不同互叶白千层优良单株诱导的芽形态不同，有的以单芽为主，有的以丛生芽为主。
（3）继代增殖培养 3个高精油无性系诱导培养40d或小芽长0.4～0.5cm时转入继代增殖培养基（B1＋1.5mg/L 6-BA＋0.01mg/L NAA），其增殖系数分别为4.1、5.3、5.6，且有效芽苗率（高1cm的芽苗为有效芽苗）均达90%以上。在继代培养基中添加0.4～0.6mg/L GA3，芽苗整齐、粗壮，平均每瓶有效芽苗数达17～22株。
（4）生根培养 取高1.0cm以上的小苗，转入培养基（1/2 MS＋0.5mg/L ABT＋0.5mg/L NAA）中生根，但不同无性系生根率差异较大。
（5）炼苗和移栽 以纯黄心土为移栽基质，炼苗30d，3个无性系平均移栽成活率高达84.8%。
诱导和增殖培养基含蔗糖30g/L，生根培养基含糖15g/L，pH值均为5.7～5.8，琼脂5.5～6.0g/L。培养温度白天（27±2）℃，夜晚（22±2）℃，继代培养光照强度1500～2000lx，生根培养前7d放置在无直射光源处，培养15d后，以自然散射光为辅助光源，光照强度约为3000lx。
20．降香黄檀
降香黄檀（Dalbergia odorifera）属蝶形花科落叶乔木，国家二级保护树种，为中国最常见珍贵的红木品种。
（1）外植体消毒 选取8～9月降香黄檀半木质化枝条，用自来水冲洗5～10min，洗涤剂溶液浸泡10～15min，自来水冲洗干净，0.1%新洁尔灭浸泡15～20min，自来水冲洗干净，在超净工作台上用75%乙醇浸泡30s，0.1%升汞10～12min，无菌水冲洗4～5次。切去茎段上下两端，保留长度约为1cm左右的带腋芽茎段作为外植体。
（2）腋芽诱导培养 外植体接种于改良DCR（增加KNO3 460mg/L）＋2.0mg/L 6-BA＋0.1mg/L的培养基中，茎基部产生愈伤组织，腋芽萌发，茎叶绿色，生长基本正常。
（3）继代培养 将外植体诱导生长正常的茎芽切下，转入改良的继代增殖培养基中（MS1＋0.5mg/L 6-BA＋0.1mg/L NAA），该培养基作为继代培养基经多次继代培养不产生褐化现象。
（4）生根培养 当继代茎芽高1.5cm时，切下接种于改良MS＋0.5g/L AC，含适量植物生长调节剂的培养基中生根。该方法生根率90%，生根过程中芽基部仍然有少数愈伤组织出现。
诱导和增殖培养基含蔗糖30g/L，生根培养基含糖20g/L，pH值均为5.8，琼脂3.5g/L。培养温度（26±2）℃，外植体诱导第一周无光照，以后光照强度均为20～25μmol/（m2·s），光照时间12h/d。
二、植物细胞培养生产次级代谢产物
1．茶树愈伤组织培养生产茶氨酸
茶氨酸是一种非蛋白氨基酸，主要存在于山茶科植物中，占干茶称重的1%～2%，具有多种生理功效，包括抗氧化、抗肿瘤、降压安神、减少体脂、提高机体免疫与抗衰老等。茶氨酸可抑制其他食品中的苦味和辣味，改善食品风味，在食品和医药行业中具有很高的应用前景。
以龙井茶的春梢嫩叶为外植体，经常规表面消毒后接种于愈伤组织诱导培养基。在培养基中添加不同浓度的植物生长调节剂，愈伤组织形成的起始时间在10～20d内变化。愈伤组织初期生长缓慢，组织坚实，继代培养后愈伤组织逐渐疏松，生长速度加快。用蔗糖、葡萄糖作为培养基碳源，其生长速率、茶氨酸含量接近；用乳糖作为碳源时，其生长速率、茶氨酸含量都低于蔗糖、葡萄糖为碳源的培养基。茶氨酸在愈伤组织中的积累以温度20～28℃较好，最佳积累茶氨酸的温度是25℃。光照有利于愈伤组织生长，但对茶氨酸积累不利。暗培养不利于愈伤组织的生长，但茶氨酸积累却大幅度提高。茶愈伤组织在暗培养条件下培养，培养基添加6%蔗糖、2mg/L IAA、4mg/L 6-BA、25mmol/L前体物质（盐酸乙胺），愈伤组织的生长周期与茶氨酸的积累曲线几乎同步。茶氨酸在第5周达到高峰，其量达到201.6mg/g。
龙井品种“碧云”嫩叶经表面消毒后诱导成愈伤组织，3周继代培养一次。将块状愈伤组织接种于液体培养基（MS＋2mg/L IBA＋4mg/L 6-BA＋25mmol/L 盐酸乙胺），采用水平振荡，转速90～110r/min，振幅2～4cm，100mL锥形瓶中加入30mL培养基，2周继代培养一次。经液体振荡培养后，细胞分散情况好，大块的聚集体少，总细胞量最高。取继代培养所得的培养物，经倾倒法弃掉瓶底沉积的块状聚集体，摇匀后，取250mL锥形瓶，以30%装液量装入液体培养基，以占培养基总体积33%的接种量接入悬浮细胞，进行培养。茶细胞总量在15～21d时达到最高值，而茶氨酸积累的最高值出现在27d前后，这说明茶细胞的代谢产物茶氨酸的合成具有滞后性，但在21d时茶氨酸积累也已达到27d时的98.45%。经培养基成分优化后，每克干茶细胞中茶氨酸含量可达233.25mg。因此，锥形瓶装其体积30%的培养液，接入1/3培养液体积的悬浮细胞，在转速90～110r/min、温度（26±1）℃的摇床上培养3周后，收获较为理想。
2．甘草培养生产甘草酸
甘草为植物乌拉尔甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）、胀果甘草（Glycyrrhiza inflata Bat.）和光果甘草（Glycyrrhiza glabra L．）的干燥根及根茎。以乌拉尔甘草分布最广，产量最多，质量最好。
乌拉尔甘草种子经消毒后接种于MS培养基中培养，待萌发后切取下胚轴0.5cm的小段接于愈伤组织诱导培养基（MS＋2，4-D 2mg/L＋KT 0.7mg/L＋3%蔗糖＋1%琼脂，pH5.8）上黑暗培养。4周于继代培养基（MS＋NAA 2mg/L＋KT 0.7mg/L＋3% 蔗糖＋1%琼脂，pH5.8）上继代1次，培养条件同上。
将2g新鲜愈伤组织转入含50mL液体愈伤组织诱导培养基的250mL锥形瓶中悬浮培养，转速110r/min，光照条件为12h/d。在悬浮培养初期，对悬浮液进行过滤，滤去较大的细胞团，得到分散性较好的悬浮细胞体系。每16d继代1次，继代时，原培养基与新鲜培养基的比例为 1∶3。在培养的第5d分别添加水杨酸、酵母提取物、水解酪蛋白等，培养16d后测定甘草酸含量，表明添加物均能较显著地促进甘草细胞中甘草酸的积累。其中添加10mg/L水杨酸，甘草酸的含量为对照组的1.86倍；添加酵母提取物可使甘草酸的含量达到14.20μg/g，是对照组的3.71倍；添加100mg/L水解酪蛋白，含量为对照组的1.69倍。经对比表明，在培养的第5d添加酵母提取物（1mg/L）促进甘草细胞中甘草酸积累的效果最佳。
3．人参细胞培养生产人参皂苷
人参（Panax Ginseng C．A.Meyer）为五加科植物，其干燥根和根茎是我国传统名贵中草药，人参中含多种有效活性成分，如皂苷、多糖和脂溶性成分等。人参皂苷是人参的主要有效成分，人参所表现出的药理活性主要是人参皂苷作用的结果。
将5年生新鲜人参洗净，经外植体消毒后，切成1cm×1cm的小块，将其接种在培养基（MS＋2，4-D 1.0mg/L＋蔗糖30g/L＋琼脂6.5g/L）上诱导愈伤组织。愈伤组织在培养基（MS＋2，4-D 1.0mg/L＋KT 0.3mg/L＋蔗糖30g/L＋琼脂6.5g/L）上继代培养。继代培养3次后，将愈伤组织打碎后接种至含50mL 液态继代培养基的250mL锥形瓶中，在100r/min的摇床上培养。培养温度为（25±2）℃，相对湿度70%，暗培养。培养20d后收集悬浮培养的细胞4g用于重新悬浮培养。经测定，人参细胞的鲜重与干重的变化趋势类似，随着培养期延长呈增加的趋势，在培养0～10d时，细胞的鲜重与干重增加缓慢，人参皂苷含量变化不大；在培养10～25d时，鲜重与干重迅速增加，鲜重（11.1g/L）和干重（496.0mg/L）在25d时达到最大，25d后鲜重和干重不再继续增加，而人参皂苷在10～20d增加迅速，20d时达到6.6mg/g DW，在20～25d人参皂苷含量和生产量下降，25d后保持稳定。因此，为了得到最大量的人参皂苷，人参细胞培养以20d为宜。经过对比研究发现，使用有滤脱的瓶盖、采用6g接种量和120r/min更有利于人参细胞悬浮培养和人参皂苷的合成。
4．鸡血藤细胞培养生产异黄酮类化合物
鸡血藤是蝶形花科植物密花豆（Spatholobus suberectus Dunn.）的干燥藤茎，是我国传统中药材，有祛风活血、舒筋活络之功效。鸡血藤其药理作用的关键活性成分是异黄酮类化合物，主要包括大豆黄酮、染料木素、刺芒柄花素和美皂异黄酮这4种主要的异黄酮活性成分。
取密花豆嫩叶，经外植体消毒后，嫩叶切成5mm×5mm的方块接种到愈伤组织诱导培养基（MS＋1.0mg/L 6-BA＋0.5mg/L NAA）。先遮光培养4d，再进行光照培养，每天光照12h，强度1200～1500lx，培养温度为（25±2）℃。14d后在叶片边缘膨大形成小芽点，30d左右完全形成愈伤组织，颜色幽绿。向培养基中添加0.10g/L VC后，愈伤组织诱导率提高到95%，且褐化现象最低，愈伤组织生长良好。在暗培养条件下继代培养，每15d继代培养一次。愈伤组织经筛选后获得浅黄色、疏松颗粒状的培养物。
将筛选后的愈伤组织5g接入300mL锥形瓶中，含100mL液体培养基（MS＋0.5g/L NAA＋1.0mg/L 6-BA＋30g/L蔗糖＋0.1g/L VC＋3g/L水解酪蛋白），于（25±1）℃暗环境下以100r/min的速度进行摇瓶悬浮培养12d。鸡血藤细胞生长曲线呈现S形分布，培养0～3d为细胞生长延滞期，生长缓慢，异黄酮合成也未开始。第4d进入指数生长期，细胞快速生长，生物量在培养的第8d达到最大（12.03g/L），异黄酮含量也在培养的第4d开始快速上升。指数生长期过后即快速进入衰亡期，稳定期较短，生物量从培养的第8d开始衰减，但异黄酮合成继续进行，异黄酮含量在培养的第12d达到最大（5.34mg/L）。经对比研究，在悬浮培养的第3d协同添加适量诱导子和前体（茉莉酸甲酯100μmol/L＋苯丙氨酸300μmol/L＋乙酸钠100μmol/L），培养21d，异黄酮含量达到最高值（19.32mg/L），为对照组的3.62倍。
5．藏红花培养生产藏红花色素
藏红花（Crocus sativus L）是鸢尾科番红花属球根类多年生草本植物，其干燥柱头作为传统名贵药材，其提取物及其提纯组分藏红花素（crocin）、藏红花苦素（picrocrocin）、藏红花酸（crocetin）等具有良好的抗肿瘤功效，我国藏红花栽培量少，产量极低，又因为其资源极其有限，不能满足藏红花市场需求。
将藏红花球茎表面消毒后切成0.5～1cm的小块；球茎表面消毒后切下芽点，置于萌发培养基上形成无菌芽，将无菌芽切成0.5～1cm的小段；藏红花球茎萌发形成4～6cm的幼叶，经外植体消毒后，切成0.5～1cm的小段。以球茎、花芽中幼叶和无菌芽为外植体接种于愈伤组织诱导培养基上进行黑暗培养。无菌芽和幼叶的愈伤组织诱导率高于球茎，诱导时间较短，但形成的愈伤组织性状不稳定，容易褐化。添加2.0mg/L 2，4-D和0.5mg/L 6-BA的MS有利于球茎愈伤组织诱导，30d愈伤组织诱导率70%以上，愈伤组织色泽橙黄，质地疏松，不透明。愈伤组织培养基为MS＋0.5mg/L 6-BA＋2.0mg/L NAA＋30g/L 蔗糖＋6.5g/L琼脂，pH 5.8～6.0，（20±1）℃，黑暗条件下培养，每28d继代一次。
悬浮培养采用改良的1/2B5培养基[KNO3、MgSO4、（NH4）2SO4、NaH2PO4用量减半]，添加20g/L蔗糖、0.5mg/L 6-BA、2.0mg/L IAA，pH 5.8～6.0，分装于250mL锥形瓶，每瓶50mL。愈伤组织接种量为12%，黑暗振荡培养25～30d，120r/min，温度（20±1）℃。分别添加一定量的壳聚糖、壳寡糖、茉莉酸甲酯、水杨酸和Cu2＋等5种诱导子，低浓度诱导子对藏红花悬浮培养细胞生长无明显影响。其中茉莉酸甲酯诱导效果最好，在细胞培养第0d添加终浓度100μmol/L 茉莉酸甲酯，藏红花色素含量达到28.57mg（以1g干细胞计），比对照提高177.9%。
6．蛇足石杉离体培养产石杉碱甲
蛇足石杉（Huperzia serrata）为石杉科石杉属的多年生小型蕨类植物。在我国主要分布于福建、两广、东北和长江流域等地区。全草可供药用，治疗跌打损伤、毒蛇咬伤、烧伤烫伤、瘀血肿痛、内伤吐血等。目前，已从蛇足石杉中提取了几十种生物碱和一些萜类等活性物质。其中从蛇足石杉中提取的石杉碱甲是一种可逆性乙酰胆碱酯酶抑制剂，对老年痴呆症的治疗非常有效，被公认是最有前途的天然抗老年痴呆症药物之一。
蛇足石杉植株秋季的半木质嫩茎，经表面消毒后接种到叶状体诱导培养基（6，7-V＋IAA 0.5mg/L）中。60d后蛇足石杉外植体分化出簇生叶状体，叶状体诱导率为50%。取诱导产生的叶状体分割成小块进行增殖培养。叶状体在添加植物生长调节剂（如ZT、2，4-D、NAA、IAA）（0.1～1.0mg/L）的不同浓度培养基上相对增长率均低于未添加植物生长调节剂的培养基。在含有20g/L蔗糖、不加任何植物生长调节剂的MS培养基上，增长率达到了1336%。进一步优化表明：1/2MS基本培养基对叶状体相对增殖率最好，平均为2087%，但是未检测出石杉碱甲；在1/4MS中生长的叶状体检测到石杉碱甲，1.18μg/g。相同光照强度的红光、蓝光、白光作光源培养叶状体，培养70d后检测目标产物。白光培养的蛇足石杉叶状体生长量及石杉碱甲累积量均最高，相对增殖率达到1548%，石杉碱甲达到1.94μg/g。12h/d光照时间的叶状体累积石杉碱甲的能力优于15h/d光照的叶状体。经条件优化后，培养30d的叶状体开始快速增殖，60d后增长量开始减慢，75d后叶状体基本不增长，叶状体生长进入稳定期，叶状体的相对增殖量达到127.3g/L。60d后石杉碱甲的累积量开始迅速增加，85d达到最大量7.57μg/g，以后呈快速下降趋势。因此，1/4MS培养基，12h/d的白光光照培养85d的叶状体增殖及石杉碱甲含量最高。
三、原生质体的培养
1．霸王的原生质体培养及植株再生
将霸王（Sarcozygium xanthoxylon Bunge）萌发的无菌苗子叶切成小块，诱导形成愈伤组织。诱导培养基：MS＋2.0mg/L 2，4-D＋0.2mg/L 6-BA＋3%蔗糖＋0.65%琼脂，pH5.8～6.2。将愈伤组织转移至含1.0mg/L 2，4-D、0.2mg/L 6-BA、500mg/L CH的相同培养基上继代培养，3周继代1次。选择淡黄绿色、生长旺盛、易分散的愈伤组织用于原生质体分离。
取继代培养14d的松软愈伤组织1～2g，置于盛有10mL酶液（2%纤维素酶、1%半纤维素酶、1%果胶酶、0.5mol/L甘露醇、0.1%MES、0.05mol/L CaCl2、pH值5.8）的锥形瓶中，在（25±2）℃、黑暗条件下静置培养12h，在恒温摇床上50r/min振荡1h，游离原生质体。酶解液用300目不锈钢筛过滤，于800r/min离心10min，收集原生质体。
原生质体悬浮于洗液中（0.16mol/L CaCl2，0.1% MES，pH5.8），用18%蔗糖溶液离心（50r/min离心15min）漂浮纯化原生质体，将漂浮的原生质体吸至新管，用洗液洗涤1次，再用原生质体培养液洗涤1次，随后计数原生质体产率和活力。每克愈伤组织可分离出2.36×106个原生质体，酚藏花红染色结果显示原生质体活力在85%以上。
纯化后的原生质体重新悬浮于培养液中，并调整原生质体至合适的密度，置于直径6cm的玻璃培养皿中，每皿2mL。此过程在（25±2）℃暗条件下进行。原生质体培养液为DPD的基本成分，同时都附加2.0mg/L 2，4-D、0.2mg/L 6-BA、500mg/L CH、2%蔗糖、0.5mol/L甘露醇，pH值5.8。培养基中的植物生长调节剂组合对原生质体再生细胞的生长状态、分裂以及克隆形成影响较大，比较6-BA（0.1～0.5mg/L）、NAA（0.5～2.0mg/L）、2，4-D（0.5～2.0mg/L）和KT（0.2～1.0mg/L）等不同植物生长调节剂在原生质体培养中的影响。结果表明，2，4-D对原生质体的分裂频率影响较大，当2，4-D的浓度从0.5mg/L增至1.0mg/L时，原生质体的分裂频率由12.8%提高到28.4%，而当2，4-D过高（2.0mg/L）时反而会抑制细胞生长导致分裂频率降低。6-BA、NAA以及KT等对原生质体的分裂也均有较为明显的影响，例如KT的加入有助于提高分裂频率。在1.0mg/L 2，4-D、0.2mg/L 6-BA和0.2mg/L KT组合中，霸王原生质体的最佳培养密度为2×105个/mL，此条件下培养7d发生分裂频率可达28.4%。原生质体培养24h后，体积增大并变成椭圆形，细胞壁合成，3～4d出现第1次细胞分裂，之后持续分裂。原生质体培养2周左右形成小细胞团，大约4周后形成直径2mm的肉眼可见的小愈伤组织。移至弱光下继续培养，愈伤组织能进一步形成淡黄色质地疏松的愈伤组织。将愈伤组织置于MS固体继代培养基上扩增，并移至光照条件下培养，愈伤组织可转变成淡黄绿色。大约经3周后将愈伤组织转到分化培养基上。在2500lx光照下，培养2周后出现绿色芽点，继而形成丛生芽。当丛生芽长到1～2cm高时，移入生根培养基，约15d有不定根出现，3周后形成完整植株。
2．“过山香”香蕉原生质体培养及植株再生
“过山香”香蕉吸芽经外植体消毒后，将顶芽茎尖平均纵切为4块，接种到不定芽分化培养基（MS＋6-BA 22.2μmol/L＋NAA 0.05μmol/L）中诱导不定芽的分化；分化的不定芽转移到增殖培养基（MS＋6-BA 17.8μmol/L＋NAA 0.10μmol/L＋腺嘌呤 29.85μmol/L）扩繁。挑选增殖培养第3代且幼嫩粗壮的不定芽，切除上部叶鞘至基部1cm处，逐层剥离剩余叶鞘组织后置于继代培养基（MS＋6-BA 100μmol/L＋IAA 1μmol/L）中培养。经过一定次数的继代培养后可获得类似花椰菜结构的多芽体。用尖嘴手术刀将多芽体从接合部位分离，切取单个球状茎顶端3mm×3mm×1.5mm（长 ×宽 ×厚）的薄切片，置于愈伤组织诱导培养基（1/2MS＋VC 10mg/L＋2，4-D 5mg/L和ZT 1mg/L＋琼脂粉 7.0g/L）中培养。挑选易松散的白色或浅黄色愈伤组织为“过山香”香蕉的胚性愈伤组织，用于原生质体分离与培养。
取贡蕉花蕾中刚坐完果的雌花，剥取花序顶端1.5cm长的部分，经外植体消毒后，将花梳置于愈伤组织诱导培养基中培养。在小花基部开始出现乳白色或浅黄色圆球形、质地致密的分生小球体。经过2～3个月的培养，在小球体旁出现松散易碎的浅黄色愈伤组织。经多次继代和筛选培养可得到大量浅黄色的贡蕉的胚性愈伤组织，用作原生质体培养的看护细胞。
“过山香”香蕉胚性愈伤组织和贡蕉胚性愈伤组织在液体培养基（MS＋100mg/L麦芽水解物＋680μmol/L谷氨酰胺＋4.1μmol/L生物素＋4.5μmol/L 2，4-D＋130mmol/L蔗糖）中，黑暗、（27±2）℃条件下培养，每15d继代一次。
在最近继代的4～7d时取香蕉胚性愈伤组织，用200μm的筛网过滤后，取细胞密实体积0.5mL的胚性愈伤组织加入到10mL酶液（3.5%纤维素酶 R-10、1%离析酶R-10、0.15%果胶酶Y-23、204mmol/L KCl、67mmol/L CaCl2、0.41mol/L甘露醇，pH 5.6～5.8）中，酶解8～11h后，采用过滤离心法进行原生质体的洗涤和纯化。刚分离的原生质体球形，细胞质浓厚，内含物丰富，细胞大小不一。原生质体产量为3.1×107个/mL胚性愈伤组织，活力85%以上。
将原生质体密度调整到1×105个/mL，以贡蕉胚性愈伤组织作看护培养细胞，在制作好的看护培养基上覆盖混合纤维素滤膜，将1mL原生质体悬浮液转移到混合纤维素滤膜上进行培养。培养基组成为：MS＋100mg/L麦芽水解物＋680μmol/L谷氨酰胺＋4.1μmol/L生物素＋0.5mmol/L MES＋4.5μmol/L 2，4-D＋117mmol/L蔗糖＋0.4mol/L葡萄糖，pH5.7，过滤灭菌。经过3d的培养，原生质体变成椭圆形的细胞，细胞质浓厚，内含物丰富；经过7d左右的培养，原生质体开始第一次分裂，随后进行第二次分裂；经过20d的培养，成为肉眼可见的细胞团；45d时可见大量的肉眼可见的细胞团。所形成的细胞团细胞质浓厚、球形，具有典型的胚性细胞特征，转移到体胚诱导培养基上能进一步分化。
经看护培养获得的细胞团在体胚诱导培养基上培养20～25d左右，可见到长椭圆形、直径大约1.0～1.5mm的发育成熟的体胚。这些体胚在新鲜的体胚诱导培养基上再经过30d的培养，7.8%的体胚萌发。萌发的体胚在培养基（MS＋0.1%活性炭）上30d后发育为10～12cm高的幼苗；在温室驯化培养3个月后长成健壮的植株。
3．番石榴原生质体培养
将番石榴“Beaumont”无菌丛生芽叶片剪成0.5mm的细条，转入含有5mL酶解液[酶占比6%，离析酶∶纤维素酶∶半纤维素酶＝0.5∶0.4∶0.1，细胞原生质体洗涤液（CPW）、0.75mol/L甘露醇或山梨醇，pH 5.8，过滤灭菌]的100mL锥形瓶中。在黑暗27℃条件下45r/min旋转振荡培养10h，采用75μm不锈钢滤网和40μm尼龙滤网过滤，过滤物转移到15mL离心管中，100g离心5min，弃去悬浮物，原生质体重新悬浮于无酶液的CPW等渗盐溶液中。将2mL粗制原生质体悬浮物置于4mL 25%糖溶液中，80g密度梯度离心3min，用去尖的巴氏吸管收集密度梯度中部的原生质体，重悬于新鲜培养液中。原生质体得率>3.7×106/mL，活力>90%。
原生质体培养的基本培养基：MS中无NH4NO3，附加20mg/L VB1、10mg/L VB6、2mg/L烟酸、5mg/L泛酸、30mg/L VC、1.5mg/L谷氨酰胺、100mg/L肌醇、50mg/L脯氨酸、30g/L蔗糖及山梨醇或甘露醇，pH 5.8，过滤灭菌。原生质体培养在无菌状态下用海藻酸钠微球培养或涂布培养。
海藻酸钠溶于等渗溶液中，浓度4%，过滤灭菌。用无钙离子的培养液调整原生质体密度为1×105个/mL，再与海藻酸钠溶液混合。混合物逐滴加入到含有50mmol/L CaCl2、无海藻酸钠的培养液中。经1h固化后，海藻酸钙凝胶微球用培养基洗涤2次，每次10min，取10mL培养液含有10个凝胶微球，置于100mL锥形瓶中，每天光照4h，光照强度15μmol/（m2·s），27℃条件下30r/min旋转振荡培养。每4d用15%无甘露醇的培养液替换原培养液。
经过3周的培养，海藻酸钠钙凝胶微球中长出微小的细胞团。2mL离心管中加入1.5mL 20mmol/L柠檬酸钠缓冲液（pH 7.4），取3个海藻酸钠钙凝胶微球置于管中，每5min轻轻颠倒10次，使凝胶溶解，细胞团释放到溶液中。45g低速离心收集细胞团，再用柠檬酸缓冲液清洗细胞团1次。细胞团重悬于0.5mL液体培养基中，将其加入到含有1mg/L NAA固体培养基的培养皿中进行涂布培养。每平方厘米可形成肉眼可见的微小愈伤组织18个。经过4周的培养，3个微小愈伤组织（大约3mm3）被置于芽再生培养基，其中含有3.4mg/L的KT和6-BA的混合物（KT∶6-BA＝0.6∶0.4），在27℃、光照时间16h/d、强度40μmol/（m2·s）条件下培养。8周后4片叶子或以上的芽数量>12。芽在培养基（MS＋0.1mg/L IBA）上生根，4周后移栽于混合栽培基质（珍珠岩10%、泥炭土70%、蛭石20%）的花盆中，用1/8MS无机盐溶液浇灌4周。
4．美国榆原生质体的培养
美国榆无菌苗嫩叶剪碎用无菌水冲洗，然后悬浮于含有700mg/L MES的4.8%海藻酸钠溶液（pH5.7）中，缓慢滴加1% CaCl2溶液，固化30min，形成海藻酸钙微球。微球用无菌水洗涤3次，转入125mL锥形瓶中，锥形瓶中含有25mL培养基，其成分为：MS无机盐和维生素，3%蔗糖，5μmol/L 6-BA，1μmol/L NAA，100μmol/L 2-氨基吲哚2-磷酸（AIP），pH5.7。培养1个月后，在培养液中形成了浓的细胞悬浮物，以其为原生质体分离的起始材料。悬浮培养物每2周继代培养1次。
将细胞悬浮培养物转入50mL离心管中，90g离心6min，保留沉淀的细胞。细胞重新悬浮于过滤灭菌的混合酶液（包含CPW盐溶液、91g/L甘露醇、500mg/L MES、2g/L纤维素酶、1g/L离析酶、0.3g/L果胶酶，pH5.5）中，再转入培养皿中25℃黑暗静置培养2h。用100μm尼龙网过滤获得的悬浮物，并收集原生质体，90g离心6min，1mL CPW重新悬浮原生质体。转入25mL CPW21洗液中，90g密度梯度离心10min。吸取两项中间的原生质体至15mL离心管中，加CPW溶液至10mL，90g离心6min，弃上清液。原生质体重新悬浮于修改的KM5/5培养液（KM培养基无机盐和维生素、10%甘露醇、500mg/L MES、5μmol/L 6-BA、5μmol/L NAA，pH 5.7）中，调整密度至2×105个/mL。原生质体悬浮液与含1.6%低熔点琼脂糖的CPW溶液等体积混合，混合液滴入24孔细胞培养板，每孔1滴，凝固后，每孔加入25μL KM5/5培养液。在黑暗条件下，10r/min回旋振荡培养，每2周更换一次培养液，如发现褐化，则添加10μmol/L AIP。培养24h，可观察到细胞壁形成，培养48h即可观察到细胞分裂，培养6d，细胞分裂比例为37.5%，细胞形态正常。
经培养，琼脂糖凝胶微球中形成微小的愈伤组织，细胞和细胞团逐渐释放到液体培养基中。取含有细胞团的培养液转入KM5/1培养基（KM培养基无机盐和维生素、3%蔗糖、5μmol/L 6-BA、1μmol/L NAA，0.22%植物凝胶，pH 5.7）中培养。愈伤组织转入ERM培养基（MS无机盐、3%蔗糖、10μmol/L或20μmol/L TDZ）进行不定芽诱导，大约14%的愈伤组织形成不定芽。切去不定芽转入丛生芽诱导的ESM培养基（DKW培养基无机盐和维生素、3%蔗糖、2.2μmol/L 6-BA、0.3μmol/L GA3、0.22%植物凝胶）。丛生芽在RM培养基（DKW培养基无机盐和维生素、3%蔗糖、0.5μmol/L IBA、0.6%活性炭、0.22%植物凝胶）上生根。经过1～2个月的培养后进行炼苗移栽，成活率51%。
5．合欢花的原生质体培养
合欢花（Albizia julibrissin）种子用自来水冲洗20min，浸于85～90℃热水中，自然降到室温。然后将种子用70%乙醇浸泡3min，转入20%的消毒液（含5.25%NaClO）中3min，无菌水冲洗3次，每次3min，吸干种子水分，接入MS基本培养基，在（26±2）℃、光照时间16h/d、光照强度40μmol/（m2·s）条件下进行种子萌发。种子培养6～10d开始萌发，取培养4～5周顶端的全展叶片作为原生质体的分离材料。如果用愈伤组织，则种子在黑暗环境下培养10～14d以获得黄化的下胚轴，下胚轴剪成5～7mm，平放在培养基（MS＋0.2g/L肌醇＋10.8μmol/L NAA＋4.4μmol/L 6-BA）上，诱导白色、易碎的愈伤组织。
酶液组成为：1.5%纤维素酶R-10和1%果胶酶Y23，均溶于含有0.7mol/L甘露醇和5μmol/L MES的CPW溶液（pH 5.5～5.8）。酶液贮存于－20℃，每管5mL分装，使用前在55℃水浴10min。
取1g叶片剪成小条，或1g愈伤组织置于20mL含有0.7mol/L甘露醇或山梨醇的CPW溶液中。在黑暗、（25±2）℃条件下，叶片小条预处理60min，愈伤组织预处理90min。取250mg预处理材料转入含有5mL酶液的CPW溶液中，在黑暗、（25±2）℃条件下，40r/min摇床振荡培养6h。再加入等体积含0.7mol/L甘露醇的CPW溶液，用0.75μm尼龙网过滤，去除杂质，滤液转入15mL含0.7mol/L甘露醇的CPW溶液的离心管中，100g离心5min，弃去上清液，保留原生质体。用含0.7mol/L甘露醇的CPW溶液洗涤原生质体，100g离心3 min，弃去上清液，用3mL KM液体培养基重新悬浮原生质体。原生质体密度7.77 × 105个/g组织鲜重，原生质体活力94%。
原生质体置于10mL CPW溶液中，室温放置30min。KM8P基本培养基添加2.7μmol/L NAA、2.2μmol/L 6-BA、0.2%MES、1.4%琼脂糖维持在45℃。调整原生质体密度为3.5×105个/mL，将其与KM8P培养液1∶1室温下混合，取2mL于60mm×12mm培养皿中静置60min，加入相同成分的KM8P液体培养基5mL，加入8%蔗糖溶液10mL，轻混匀，用封口膜密封，在（25±2）℃、黑暗条件下30～40r/min振荡培养。在小细胞团形成过程中如发现褐化，重新更换KM8P液体培养基和蔗糖溶液。
培养过程中原生质体逐渐生长，在琼脂糖中形成细胞团并释放到培养液中。如果液相中出现褐化时，更换50%（体积分数）新鲜培养液。更换出的旧培养液用5mL离心管收集，40g离心，弃去上清液，管底的细胞团用KM8P培养液洗涤，离心，收集细胞并用1mL KM8P培养液重新悬浮，涂布于无甘露醇的固体培养基，在100mm×12mm培养皿中培养，6h/d光照，光照强度6～8μmol/（m2·s）。培养3周，叶片分离的原生质体在每个培养皿中有52.3个小细胞团形成，愈伤组织分离的原生质体在每个培养皿中有49.3个小细胞团形成。挑取直径2～4mm的小细胞团，转入含有B5有机成分和MS无机盐的培养基，附加3%蔗糖、0.8%琼脂、10.8μmol/L NAA、4.4μmol/L 6-BA、0.2g/L水解酪蛋白。培养过程中，愈伤组织2周继代培养1次。在培养基（MS＋13.2μmol/L 6-BA＋4.6μmol/L ZT）上诱导不定芽。培养5周时，不定芽形成频率为78%～93%，每块愈伤组织上有芽3～4个。在生根培养基（1/2MS＋4.9μmol/L IBA）上进行生根培养。培养4～5周时，从叶片分离原生质体来源的不定芽生根为68%，从愈伤组织分离原生质体来源的不定芽生根率为61%。生根后炼苗移栽。
6．二倍体马铃薯原生质体培养
脱毒马铃薯RH2（IVP48-168）无菌苗，取培养20d左右的叶片，20℃黑暗条件下放置48h。然后转入CM中4℃培养24h。再将叶片切成1～2mm细条，加入到过滤灭菌的酶液（0.35mol/L 甘露醇、2.0%纤维素酶、0.2%果胶酶）中酶解4h，温度（20±1）℃，黑暗处理，40～45r/min振荡。酶解后用300目筛过滤，将滤液转入离心管，100g离心5min，收集原生质体，稀释、清洗2次，沿管壁缓慢滴入到加装23%蔗糖6～8mL的离心管中悬浮，80g离心9min，收集中间界面的原生质体，再洗涤2次，离心收集原生质体。所获得的原生质体完整率达到68.8%，原生质产量和活力分别为17.5×105和80.9%。原生质体活力较高，总体效果较好。
将纯化的原生质体密度调整为1×104～1×105个/mL，在原生质体液体培养基上浅层静止培养，7d后补充1/3新鲜培养基。原生质体在液体培养基上培养3d左右，开始形成细胞壁，细胞逐渐由圆球形变为椭球形。5～7d时细胞发生第一次分裂，然后持续发生二次分裂和多次分裂，15d左右形成多细胞的细胞团。将其悬液接种在固体培养基上进行固-液双层培养，继续培养20d左右，形成肉眼可见的小愈伤组织。将愈伤组织挑出接种到增殖培养基上，在光照2000～3000lx、温度（25±1）℃条件下培养。待愈伤组织长至2～3mm时，转到分化培养基上，愈伤组织逐渐变绿，结构逐渐致密。培养50d左右，胚性愈伤组织开始分化出芽。将芽切下，放入MS培养基，7d左右生根，形成完整植株。RH2愈伤组织发育快，分化能力强，可获得大量再生植株。
四、毛状根的诱导与培养
1．乌拉尔甘草毛状根的诱导与培养
乌拉尔甘草（Glycyrrihizag uralensis Fisch）是中国重要的传统中药材，以根和茎入药。其主要药用成分为甘草酸和甘草黄酮。人工种植甘草周期较长，且部分药用成分含量远低于野生甘草，从而限制了甘草资源的开发与利用。选取饱满的甘草种子，先用98%浓H2SO4处理30min，然后经外植体消毒，接种于1/2MS培养基上，萌发无菌苗，以株龄14d的活体幼苗、无菌苗子叶和下胚轴作为转化外植体。
取出保存于－70℃冰箱中的原始发根农杆菌15834、A4菌种，划线接种于YMB固体培养基，28℃培养2d，挑取单菌落接种于含Amp 50mg/L的YMB液体培养基中，28℃下180r/min振荡培养至OD600值0.6～0.8。收集菌液，8000r/min离心10 min，弃上清液，加MS液体培养基稀释菌液至OD600值0.6，加入乙酰丁香酮至浓度为100μmol/L，28℃下180r/min振荡培养2h，用于甘草遗传转化。
用发根农杆菌菌液对乌拉尔甘草幼苗的下胚轴进行穿刺侵染2～3次，然后将幼苗接种于含乙酰丁香酮100μmol/L的1/2MS培养基上共培养5d。将幼苗转至含300mg/L头孢霉素的1/2MS培养基中培养，7d后在幼茎穿刺部位诱导出大量白色的丛生毛状根，剪取2～3cm长的毛状根转入含300mg/L头孢霉素的1/2MS固体培养基进行除菌培养，每周继代培养1次，逐渐降低头孢霉素浓度，直至无菌。剪取2～3cm的无菌毛状根接种于1/2MS固体培养基中培养。该方法采用农杆菌菌株15834转化率达到79.5%，并且在培养的第5d即可在针刺部位形成白色根端，7d时发育成丛生毛状根。
甘草无菌苗子叶切成0.5cm2的小块，下胚轴切成约1.0cm的小段，用无菌针刺出小创口，分别侵入发根农杆菌菌液中，侵染15～20 min，吸干多余菌液，置于含乙酰丁香酮100μmol/L的MS培养基上，黑暗条件下共培养48h，转接至含500mg/L头孢霉素的1/2MS培养基上，28℃、光照时间12h/d、光照强度2000lx条件下培养。剪取2～3cm的毛状根转入1/2MS固体培养基中培养，12～14d后，陆续从外植体伤口处产生白色毛状根，毛状根分枝较多，且无向地性。发根农杆菌15834和A4转化时，以子叶为外植体的毛状根诱导率分别为24.9%和14.3%，而下胚轴的转化率更低。经PCR检测，毛状根中存在发根农杆菌T-DNA片段中的rolA和rolC基因序列，未检测到发根农杆菌病毒区VirD2基因片段，证实了发根农杆菌中基因片段已整合到甘草基因组中。
剪取生长迅速毛状根根尖分别接种在不含植物生长物质的MS、1/2MS、1/2B5和B5培养液中，置于150mL锥形瓶中，每瓶装培养液50mL，在（25±0.5）℃条件下110r/min振荡暗培养，培养周期为35d。乌拉尔甘草毛状根在无植物生长调节剂的1/2MS培养液中的生长最显著，形成分枝较多，毛状根的生物量最大，培养25d，毛状根增殖倍数达到19.13倍（鲜重）；在MS培养液中增殖倍数达到11.57倍；在1/2B5培养液中生物量最低，培养7d毛状根褐变严重，且根尖出现明显愈伤组织，抑制了毛状根生长，增殖倍数仅为2.35倍。培养35d，毛状根生物量与其最大值比较均有所下降。
2．催眠睡茄毛状根的诱导与培养
催眠睡茄（Withania somnifera L．）为茄科睡茄属植物，是印度传统中草药，可全草入药。催眠睡茄含有睡茄素类、醉茄素类等各种生物碱，具有抗炎、抗压、抗氧化、抗肿瘤等功效；睡茄素A是睡茄属植物的主要药用成分，集中在植株的根部。将发根农杆菌C58C1在含40mg/L利福平（Rif）的YEB固体培养基上划线培养，挑取单菌落，接种于10mL含40mg/L Rif的YEB液体培养基中，200r/min、27℃振荡培养（以下条件相同）24h，取100μL菌液接种于50mL含40mg/L Rif的YEB液体培养基中，振荡培养约12h至A600为0.3左右，加入乙酰丁香酮（AS）至终浓度为100μmol/L，继续活化3h。取50mL菌液4000 r/min离心10min，收集菌体，用50mL含100μmol/L AS的MS液体培养基重悬菌体，继续振荡培养30 min，获得菌液用于转化催眠睡茄。
将培养20d的催眠睡茄幼苗的叶片浸入C58C1的菌液中，振荡20min，用无菌滤纸吸干叶片表面的菌液，接种到含100μmol/L AS的MS固体培养基上，27℃黑暗条件下共培养4～5d，当叶片周围有菌圈出现时，取出叶片，无菌水200r/min振荡洗涤3次，每次10min，吸干水分，接种到含300mg/L头孢噻肟钠（Cef）的MS固体培养基上，光照培养，每4d更换1次培养基。培养10d左右开始有毛状根出现，15d时毛状根诱导率达30%，每块外植体上平均诱导4条毛状根，表现出无向地性、绒毛较多的特点。当毛状根生长至3cm左右时，剪下分别接种到含300mg/L Cef的1/2MS培养基上，每7d剪取根尖继代培养，继代5～6次后，将毛状根转移至YEB琼脂培养基上培养7d，无农杆菌污染的毛状根接种于1/2MS液体培养基中，110r/min、27℃振荡培养。取催眠睡茄毛状根进行PCR检测virD基因和rolB基因，排除农杆菌基因组对毛状根基因组污染，阳性率为96.67%。选择性状保持稳定且生长迅速的阳性毛状根克隆进行扩大培养30d，此时毛状根出现轻微的褐化现象。收集毛状根，经冷冻干燥、粉碎、过筛后提取睡茄素A进行HPLC检测。检测的10个毛状根系中睡茄素A的含量都显著高于野生催眠睡茄根的含量，平均质量分数为1.588mg/g，是野生植株平均含量的1.96倍，其中毛状根系M3的睡茄素A含量最高（1.783mg/g），是野生催眠睡茄植株平均含量的2.21倍、根的1.51倍。
3．人参毛状根的诱导与培养
人参（Panax ginseng C．A.Meyer）是一种以人参皂苷为主要药用成分的多年生植物，生长周期长，一般种植6年以后才能采收。人参栽培对土壤环境有着严格的要求，我国传统栽培人参方法是开垦林地种植，对森林资源破坏极其严重。况且种植过人参的土地20～30年不能再次种植人参。人参的药用部位是根生产毛状根，从其中提取人参皂苷等次生代谢产物。
发根农杆菌A4菌用YEB液体培养基在120r/min、28℃振荡黑暗培养过夜，所获菌液用于人参遗传转化。取2年生的根消毒后，切成0.2～0.3mm薄片，接种于MS基本培养基上。将菌液通过微量注射器注入人参薄片中，将人参薄片在25℃、光照14h/d、光照强度2000lx或黑暗条件下培养，诱导毛状根。培养6周时，毛状根开始形成，诱导率达到31.6%。同时发现光照与否对毛状根的形成无明显影响。当毛状根形成后，剪取1cm长的毛状根转移至含500mg/L羧苄青霉素的MS培养基上进行除菌培养，每5～7d转接一次，直至无菌。除菌后的毛状根表现出多分枝、丛生、无向地性的特点，在1/2MS无植物生长物质培养基上25℃黑暗培养，每4周继代培养一次。人参毛状根经冠瘿碱检测和Southern杂交证实为转基因根系。生长速率比较发现，不同的转化之间生长速率有明显差异，其中根系R9923拥有最高的生长速率。
人参毛状根R9923液体振荡培养4周，增长速率达到28.8倍，人参皂苷含量达到1.54%，人参皂苷产量达到0.432g/L。经放大培养，人参毛状根R9923在MS液体培养基中，110r/min、25℃、黑暗条件下振荡培养时，生长速率达到7.97倍，倍增时间接近5d，生长曲线类似于指数增长。人参毛状根经4周的液体振荡培养，所获得毛状根经人参皂苷总含量接近于6年生的人参中皂苷含量。这说明人工培养人参毛状根是一种可行的商业化生产药用成分人参皂苷的途径。
4．伞形花耳草毛状根的诱导与培养
伞形花耳草（Oldenlandia umbellata）是茜草科耳草属草本植物，根系十分发达，在印度和斯里兰卡名为 Chay-root。根中富含蒽醌类化合物，常用于提取染布用的染料，染出的布为暗红紫色，经久不褪色。
取－70℃保存的野生型发根农杆菌菌株532，活化培养3d，连续继代培养3次，转入YEB液体培养基中，25℃、250r/min条件下振荡培养16h，此时菌液处于对数生长期。收集菌液，5000r/min离心10min，弃上清液，菌体用含3%蔗糖的液体MS培养基重新悬浮，调整OD600到0.4～0.6之间。
经带节茎段培养获得的无菌苗，取培养5周高5～7cm的植株叶片作为预培养材料。剪取生长15d的叶片，在叶脉处划出3～4条伤口，接入100mL含25mL菌液的锥形瓶中，在25℃、黑暗条件下，250r/min振荡培养3h。在培养皿中放置滤纸，用1/2MS培养液浸湿，取出叶片转到滤纸上，在（25±1）℃、黑暗条件下进行24h、48h、72h和96h共培养。其中共培养时间48h，毛状根诱导率达到86.67%，与其他共培养时间组比较有显著性的差异。随着共培养时间（>48h）的延长，每个外植体形成的毛状根数量逐渐减少，毛状根褐化比例增加。共培养过程中添加200μmol/L乙酰丁香酮（AS）可以显著提高毛状根诱导率（95%），并且增加每个外植体形成的毛状根数量。过量添加AS，则毛状根诱导率和每个外植体形成的毛状根数量均有显著下降。
共培养后的外植体用含有500mg/L氨苄青霉素的无菌水清洗，将外植体近轴面贴在1/2MS（含500mg/L氨苄青霉素、0.8%琼脂、3%蔗糖）固体培养基上培养。每2d转接1次，逐渐降低抗生素浓度，从250mg/L到100mg/L。再将外植体转入添加植物组培抑菌剂的培养基上清除杂菌，然后转入无抗生素的MS培养基上培养。
选取生长快的2～3cm长的毛状根，单独接种于1/2MS（含3%蔗糖）液体培养基中，120r/min振荡培养2周。每一根系分3份转接于3瓶中扩大培养。经分子生物学的PCR方法证实，毛状根中存在基因rolA、rolB、rolC，在检测的毛状根中没有rolD基因存在。
叶片诱导的毛状根形态细长、密集，多分枝，生长快。选取10个毛状根根系转入MS液体培养基中培养，表现出显著差异。L3在连续的继代培养过程中，鲜重、干重和蒽醌含量表现稳定，继代培养中测量数据无显著性差异。其中蒽醌含量在10.38～10.45mg/g DW之间变化，表现出转基因根系的遗传稳定性。将L3转入MS液体培养基，在培养的10～15d，快速生长；在随后的培养过程中，蒽醌含量增加。对蒽醌类化合物中的羟基茜草素用HPLC检测分析，伞形花耳草毛状根和野生伞形花耳草根中均含有羟基茜草素。其中野生伞形花耳草根中羟基茜草素含量为6.08mg/g DW；毛状根中羟基茜草素含量21.83mg/g DW，比野生的高出260%。
五、转基因植株的诱导与培养
1．玉米转基因体系的建立
玉米既可食用也可以作为工业原料。中国是世界上第二大玉米生产国，在中国经济生产中具有重要的战略地位，其遗传转化研究具有明显的理论和应用意义。
取人工授粉后9～12d的多个玉米品系的雌穗，4℃冰箱存贮3～4d，室内去苞叶，用70%乙醇擦拭表面，再用0.1%HgCl2浸泡5min，无菌水冲洗4～5次，切去3/5籽粒，取同一部位长度为1～2mm的幼胚，盾片朝上分别接种于11个因素比较的胚性愈伤组织诱导培养基。15d继代1次，温度27℃，光照12h。结果表明：基因型对玉米胚性愈伤诱导具有决定作用，即使改进培养条件也难使一些玉米品种诱导出胚性愈伤组织。6-BA、培养基、AgNO3、2，4-D、ABA对胚性愈伤诱导的影响达到显著水平。其中生长素维持在2mg/L，细胞分裂素保持在低水平，有利于胚性愈伤组织的诱导；ABA以2mg/L的浓度隔代补充，愈伤组织生长快、易碎、分散性好、颜色鲜黄，有利于胚性愈伤组织的增殖、继代、保持及后续分化。玉米品种综31在改良培养基（MB＋2，4-D 2mg/L＋KT 0.2mg/L＋ZT 0.5mg/L＋6-BA 1mg/L＋ABA 2mg/L＋L-谷氨酰胺50mg/L＋AgNO3 5mg/L）上愈伤组织诱导效果好；玉米品种黄早4 在改良培养基（MB＋2，4-D 1.5mg/L＋NAA 0.2mg/L＋KT 0.5mg/L＋ZT 0.2mg/L＋ABA 2mg/L＋甘露醇 5mg/L＋L-谷氨酰胺300mg/L）上愈伤组织诱导效果好（ABA每间隔1代添加1次）。
黄早4、综31、金黄96B和GY237的胚性愈伤组织接种于测试培养基中，培养温度 25℃，光照12h。黄早4和综31的最佳胚性愈伤组织分化培养基分别是改良NB＋6-BA 2mg/L＋KT 0.5mg/L＋ZT 0.5mg/L＋ABA 0.1mg/L＋AgNO3 1mg/L和改良 MB＋2，4-D 0.1mg/L＋KT 0.1mg/L＋6-BA 2mg/L＋ABA 0.5mg/L＋AgNO3 5mg/L。
幼胚用预先加入AS的侵染液浸泡处理，用无菌吸水纸将外植体表面菌液吸干后放入共培养基中（含有AS及500mg/L乙磺酸），暗培养3d，转入筛选培养基（含25mg/L潮霉素及500mg/L头孢噻肟钠），2周继代1次，共4次。然后黄早4和综31愈伤组织分别转入相应的分化培养基上（含300mg/L头孢噻肟钠及潮霉素由20mg/L渐降到10mg/L），获得转基因植株。
添加50μmol/L AS能启动T-DNA的转移，黄早4在150～170μmol/L、综31在170～190μmol/L达到最高的转化率。培养温度18℃有低水平的转化，24～25℃时达到最大值，而在26℃后大幅度下降。在农杆菌菌液浓度和浸泡时间方面，OD值为0.7时浸泡15min转化率最高。以抗性愈伤率为指标，黄早4和综31转化率分别达到48.6%和46.2%。
2．水稻转基因植株的诱导与培养
经过近30年的探索，水稻转基因技术取得了巨大的进步。由于水稻品种间差异较大，具有遗传的多样性，转化效率对品种的基因型依赖性较强。
成熟的不同品系种子去除硬壳，用70%乙醇浸泡2 min，0.1% HgCl2溶液浸泡30 min，无菌水漂洗3次，然后在含有2.0mg/L 2，4-D的MS基本培养基上培养。培养物在暗处于26℃培养2周，然后切下诱导产生的盾片愈伤组织，选择致密的愈伤组织颗粒，用于转化。带有Xa21基因的农杆菌培养24h至A595为0.8。离心收集农杆菌细胞，用AAM培养基洗涤1次，再悬浮在AAM中至A595为0.5（约109细胞/mL）。
将待转化的愈伤组织颗粒放入AAM农杆菌悬液中浸泡5min，然后放置于灭菌纸上，除去过多的菌液。转移到培养基（MS＋10μmol/L乙酰丁香酮）上于26℃暗培养条件下共培养2～3d。在共培养后，用无菌水彻底洗涤愈伤组织几次，然后在含噻孢霉素500mg/L的无菌水中120r/min振荡洗涤2h，洗涤后的愈伤组织铺在选择培养基（MS＋2mg/L 2，4-D＋300-500mg/L噻孢霉素＋30～50mg/L潮霉素）上培养3周。然后转移到新的选择培养基上继续培养2～3周。经两次选择培养后生长旺盛的愈伤组织在预分化培养基（MS＋5mg/L ABA＋2mg/L 6-BA＋2mg/L NAA＋50mg/L潮霉素）上26℃暗培养2～3周，然后转移到分化培养基（MS＋3mg/L 6-BA＋0.5mg/L NAA＋1.0mg/L IAA＋2.5mg/L KT＋50mg/L潮霉素）上，持续光照下26℃培养2～3周至分化出苗，当再生苗长至10cm高时移植到土壤中，在温室中长至成熟。
利用农杆菌介导的转化Xa21转入明恢63、珍汕97B、盐恢559、太湖粳6和中花11号5个水稻品种，经PCR检测和Southern杂交确定转基因的真实性，经抗性筛选获得粳稻和籼稻的转基因株系。测试水稻品种转化率在3.6%～10.5%之间，表现出籼稻转化率高于粳稻。转基因植株抗性分析表明，所有分子检测阳性的转基因植株均表现出对白叶枯病的高度抗性。转基因株系自交T1代经PCR分析和接种分析揭示的抗感分离比均为3∶1。田间试验还表明，转基因植株及其后代的其他性状均未见可察觉的变异。
3．非洲菊转基因毛状根诱导与境良
非洲菊（Gerbera hybrida）是研究花瓣形态建成调控机制的理想材料，在国际上已被作为研究复杂花序的模式植物。将－80℃保存的发根农杆菌K599、R1000和ATCC15834在含50mg/L链霉素（streptomycin，Str）的LB固体培养基上划线培养，挑取单菌落，接种于含50mg/L Str的液体LB培养基中，于28℃、230～250r/min培养至OD600为0.5～0.6。收集菌液，4500g离心10 min，含2%乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）的1/2MS液体培养基重悬菌体至OD600为0.5～0.6，备用，标记为侵染液。
将继代21～28d的无菌苗叶片的叶基部、叶顶部和叶柄，用解剖刀划出创伤口，转至MS固体培养基（pH 6.8）上，25℃黑暗预培养2d，转入侵染液中，28℃、100r/min振荡侵染5～30min。吸干外植体表面菌液并移至MS固体培养基（pH 6.8）上，黑暗共培养0～4d。经过共培养的外植体转入含250mg/L头孢氨苄（cefalexin，Cef）的无菌水中10 min，转入含250mg/L Cef的MS固体培养基（pH 6.8）上，25℃、长日照条件下（16h/d）诱导毛状根产生。产生的毛状根转移至不含植物生长物质的MS固体培养基上继续生长。
研究发现：3个发根农杆菌菌株对非洲菊品种LL叶片进行毛状根诱导，K599菌株毛状根诱导率最高（80.27%），ATCC15834最低（0.71%）。因此，后续研究选择发根农杆菌K599进行。选用4个品种的非洲菊进行毛状根诱导，品种LL毛状根诱导率最高（81.14%），与其他3个品种相比存在明显优势。非洲菊叶片叶基部的毛状根诱导效率最高（86.7%），叶基部培养18d即可见到白色毛根，叶柄26d才可见到白色毛根。最适共培养时间为2d。用带有表达载体35S：：AtHBI1-GUS的发根农杆菌K599菌液侵染非洲菊叶基部，获得转基因毛状根。经GUS显色表明，成功转化35S：：AtHBI1-GUS的毛状根出现明显的深蓝色。转入AtHBI1的毛状根生长快，出现较分枝多。与对照相比，转入HBI1的毛状根生长速率高9%。
4．黄瓜转基因植株的诱导与培养
黄瓜在生长过程中极易遭受各种病虫害及不利环境的影响，使黄瓜的产量和品质大大降低。由于种内资源有限，常规育种出现瓶颈。
取饱满的“新泰密刺”黄瓜种子预浸泡2～3h，剥除种皮后用75%乙醇消毒30s，再用6.5%次氯酸钠消毒15 min，用无菌水冲洗5次，接种在MS培养基上，28℃暗培养。培养1～2d，将子叶部分横切成4块，获得子叶外植体。如果以子叶节作外植体时要待种子萌发后转入光下培养，约4～5d后子叶呈直立状态时切取，去除1/2子叶仅留2mm的下胚轴，并在预培养基（MS＋0.5mg/L 6-BA＋2.0mg/L AgNO3）上培养2d。
选取含有目的基因载体的农杆菌单菌落，接种于50mg/L Kan和50mg/L Rif的LB液体培养基中进行摇菌，250r/min、28℃过夜培养。当OD在0.6～0.8时收集菌液，10000g离心8～10min，弃上清液，用等体积MS液体培养基重悬菌体。菌液侵染前添加0.725mg/L AS。
黄瓜子叶外植体于农杆菌悬浊液中侵染15～20min，用无菌滤纸吸干，接种在培养基（MS＋2.0mg/L 6-BA＋1.0mg/L ABA＋1.45mg/L AS）上共培养，25℃暗培养2～3d。转入培养基（MS＋2.0mg/L 6-BA＋1.0mg/L ABA＋10mg/L Hyg＋400mg/L Cef）对子叶进行筛选培养3周。此过程可形成具有抗性的再生芽，再生频率为76.5%。将具有抗性的再生芽转入含25mg/L Hyg的筛选培养基培养1周，抗性植株率降低到8.8%。经筛选后保持绿色的再生植株可转到生根培养基（MS＋1mg/L GA＋400mg/L Cef）中培养，2～3周后可发育为完整植株。对子叶再生植株进行PCR产物扩增，平均阳性率为27.8%。将PCR阳性的子叶再生植株进一步经Southern杂交检测，平均阳性率为13.9%，同时通过杂交条带数可看出目的基因均以单拷贝形式插入基因组中。
子叶节外植体在预培养基上培养2d，在农杆菌悬浊液中侵染15～20min，取出后吸干外植体表面的菌液，接种于共培养基（MS＋0.5mg/L 6-BA＋2.0mg/L AgNO3＋1.45mg/L AS）上，25℃暗培养2～3d。转入培养基（MS＋0.5mg/L 6-BA＋2.0mg/L AgNO3＋7mg/L Hyg＋400mg/L Cef）上筛选2周，可见发育出的小芽点，再生频率为51.8%。将小芽点转入培养基（MS＋0.5mg/L 6-BA＋2.0mg/L AgNO3＋15mg/L Hyg＋400mg/L Cef）上对子叶节进行高浓度筛选1周，可发育为再生芽，抗性植株率降低到29.6%。将保持绿色的再生抗性芽转入生根培养基中培养，1～2周后可获得完整植株。对子叶节外植体再生植株进行PCR检测，平均阳性率为19.3%。将PCR阳性的子叶节再生植株进一步采用Southern杂交检测，平均阳性率为6.9%。
5．马铃薯转基因植株的诱导与培养
马铃薯（Solanum tuberosum L．）为同源四倍体，具有高度杂合性，常导致自交不亲和和雄性不育，从而降低了用常规育种方法进行马铃薯改良的效率。目前，人们通过农杆菌导入外源基因来实现马铃薯的品质改良。
根据AlNHX1基因（Na＋/H＋逆向转运蛋白）全长序列设计相应引物，PCR扩增AlNHX1基因，并将AlNHX1基因构建到植物表达载体pBI121。将构建好的质粒导入农杆菌EHA105，并将菌液涂布于含有卡那霉素和利福平的YEB培养基上，挑选抗性菌落并经PCR筛选出阳性工程菌。
将马铃薯“克新18号”经外植体消毒后切成1～2mm薄片，于无菌滤纸上吸水干燥后置于诱导培养基（MS＋2mg/L ZT＋0.1mg/L NAA＋2mg/L 2，4-D＋0.3g/L酪蛋白水解物＋2.88g/L L-脯氨酸＋0.1g/L肌醇＋30g/L蔗糖）上，28℃预培养。约10d后马铃薯表面出现小颗粒愈伤组织。将马铃薯愈伤组织浸入含有重组质粒的农杆菌菌液（OD600＝0.6）中，振荡摇匀，5min后倒掉菌液。将马铃薯愈伤组织转入共培养基（MS＋2mg/L ZT＋0.1mg/L NAA＋0.3g/L酪蛋白水解物＋0.02g/L AS＋0.1g/L肌醇＋30g/L蔗糖）上，28℃暗培养2d。然后将其用无菌水和MS液体培养基各清洗3次，接种于筛选培养基（MS＋2mg/L ZT＋0.3g/L酪蛋白水解物＋2.88g/L L-脯氨酸＋0.1g/L肌醇＋0.02g/L G418＋0.4g/L头孢霉素＋30g/L蔗糖）上，28℃培养10d，转到新的筛选培养基上继代培养，直至长出绿色抗性愈伤颗粒。将筛选后的马铃薯愈伤组织转移到分化培养基（MS＋0.1mg/L NAA＋2mg/L KT＋2g/L酪蛋白＋0.1g/L肌醇＋30g/L山梨醇＋0.02g/L G418＋0.4g/L头孢霉素＋30g/L蔗糖）上，28℃光照培养，当抗性芽生长至1cm左右时移到生根培养基（1/2MS＋0.1g/L肌醇＋0.02g/L头孢霉素＋30g/L蔗糖）上诱导生根，当植株长到6～8cm时将其在温室内移栽入土。
转基因马铃薯在0.7% NaCl盐胁迫条件下植株仍能正常生长，耐盐性得到提高。转基因马铃薯中的Na＋、K＋含量及Na＋/K＋的比值均高于野生型马铃薯，表明AlNHX1基因在马铃薯中表达可以使植物细胞维持较高的Na＋/K＋，使马铃薯的耐盐性得到提高。
6．大豆转基因植株的诱导与培养
1988年转基因大豆植株获得成功，但目前转化的效率还比较低。成熟大豆“南农-34”种子经常规灭菌，接入培养基[MSB5（MS无机盐和维生素B5）＋6-BA 0.4mg/L]中萌发5～6d。用切除部分下胚轴，留3～5mm，去除1/3的子叶，在两片子叶之间纵切。将切好的子叶节浸泡于含有重组Na＋/H＋逆向转运蛋白基因的农杆菌菌液中，于25℃、180r/min振荡培养30min，吸干子叶节上的菌液，接入无抗生素的培养基中黑暗条件下培养72h，转接至芽诱导培养基（MSB5＋1.5mg/L 6-BA＋50mg/L Kan＋250mg/L Cef）中光照培养，约1周后外植体开始出现鲜绿的芽点，继代培养逐渐长成丛生芽，出芽数4～8个，约4周后，苗高可达7～10cm，且长势良好。选取带有丛生芽的外植体转接至根诱导培养基（1/2MSB5＋1.0mg/L IBA＋250mg/L Cef）中，7～10d后开始形成新生根系，3周后主根粗壮，侧根浓密。选取根长7～10cm的再生植株，经炼苗后移栽至温室内盆栽培养，获得形态特征正常的再生抗性植株。
将含有pBI121-LW重组质粒的EHA105、C58和AGL1侵染的抗性苗，切下部分组织进行GUS染色，发现EHA105侵染的外植体来源的组织中58%呈现蓝色，而C58和AGL1侵染的外植体来源的组织没有出现蓝色。表明EHA105的侵染大豆和整合外源基因的能力强于C58和AGL1；也说明质粒载体中携带的GUS基因已得到表达。在抗性植株中58%检测到LW-MRP基因，对检测结果为阳性的核酸提取产物进行测序，测序结果与目的基因序列一致，说明目的基因已整合到大豆基因组中。
大豆抗性植株叶片采用自动氨基酸分析仪检测甲硫氨酸含量，转基因大豆植株的甲硫氨酸含量有不同程度提高，甲硫氨酸含量提高最大植株达到51.11%，甲硫氨酸含量提高的平均值达到27.81%。