第二节　植物生长调节剂的应用技术

一、诱导愈伤组织

愈伤组织原指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织。它的产生是由于植物受伤部位的组织代谢发生改变，诱导生长素和细胞分裂素加速合成，促进植物受伤部位愈合的结果。植物组织培养过程中，愈伤组织是离体条件下诱导植物外植体产生的一团无序生长的细胞，主要是由活的薄壁细胞组成。它的产生是外植体在离体条件下，人为添加植物生长调节剂诱导的结果。植物的各种组织或器官都有在离体条件下诱导产生愈伤组织的潜在可能性。由于细胞全能性，植物愈伤组织具有发育成根、茎、叶或胚状体的潜能。在培养条件合适时有可能分化产生出一个完整的新植株。同时，愈伤细胞还可以用作细胞的悬浮培养，以此建立细胞悬浮系。

愈伤组织的形成分为诱导期、分裂期和形成期三个时期。对于植物细胞分裂的诱导，损伤是诱导细胞分裂的重要因素。植物受伤时，由受伤细胞释放出来的物质对诱导细胞分裂具有很大影响。一般说来，外植体细胞分化程度越高或者说细胞越成熟，所需时间就可能越长，衰老叶子比幼嫩叶子难培养，成熟的芽比幼嫩的芽难培养，休眠芽几乎不能培养成功。此时细胞原有的代谢方式改变，合成代谢活动加强，迅速进行蛋白质和核酸物质的合成。外植体细胞经过诱导后，其外层细胞开始发生细胞分裂，回复到分生组织状态。形成期是指外植体细胞经过诱导、分裂后形成了无序结构的愈伤组织的时期。形成的愈伤组织在原来培养基培养一段时间，就必须转移到新的原培养基上进行继代培养。如果不进行继代培养，愈伤组织经长期培养可能表现出遗传的不稳定和变异。愈伤组织发生的遗传变异使得由此而获得的再生植株也相应地在遗传组成上存在差异。

虽然植物的各种器官、组织或细胞都具有产生愈伤组织的潜能，但是在生产实践中诱导植物出愈伤组织，其受到外植体、培养基和培养环境等因素的影响。

1．外植体生理生化状态

外植体供体的遗传因素、基因型和外植体本身的生理生化状态对植物组织培养有直接的影响。不同的物种，诱导愈伤组织的能力有着明显差异。如胡萝卜的根容易诱导出愈伤组织，而竹子的叶就未见诱导愈伤组织的报道。外植体的取材部位以及外植体的幼嫩程度均对愈伤组织诱导和再生有影响。在玉米组织培养的过程中，基因型被认为是影响幼胚组织培养的首要内在因素。这种由基因型产生的差异主要有质效应和核效应。玉米幼胚胚龄是影响愈伤组织诱导的另一内在因素。胚龄不同，体内植物激素水平不同，直接影响愈伤组织的诱导。南方红豆杉愈伤组织诱导中，幼茎、老茎、针叶切段中，幼茎的愈伤组织产生的时间最早、诱导率最高，为最佳诱导愈伤组织的外植体。在美洲商陆愈伤组织诱导过程中，发现叶、下胚轴、根尖均有利于诱导脱分化产生愈伤组织。叶片最易诱导脱分化，下胚轴次之，根尖最难。有研究们者对多种基因型芒的研究结果表明，不同基因型愈伤组织的诱导率差异可达数倍，8种基因型芒愈伤组织的诱导率介于0.80%～91.70%之间。同时发现植物细胞壁木质素含量与其愈伤组织诱导率也存在一定的相关性。材料的基因型直接决定木质素含量的高低，木质素含量低的材料不易褐化，愈伤组织诱导率较高。芒幼穗组织处于细胞的快速生长和分化阶段，含有较高的植物生长调节剂，有利于愈伤组织的形成。

2．培养基

合理选用培养基并根据愈伤组织的生长状态改变培养基有效成分及其配比，对于诱导愈伤组织具有重要的作用。其中，植物生长调节剂是诱导愈伤组织形成的极为重要的因素。目前，用于诱导愈伤组织形成常用的生长素种类是2，4-D、IAA和NAA，所需浓度在0.01～10mg/L范围内。在大多数情况下，只用2，4-D就可以诱导外植体产生愈伤组织。但2，4-D具有诱变作用，在只含2，4-D的诱导培养基上生长的愈伤组织比较松软，呈黏液化和泡状。由于IAA具有高温分解的特点，培养基添加时需要过滤灭菌。因此，在愈伤组织诱导阶段，添加生长素类植物生长调节剂应优先考虑采用NAA，改进愈伤组织的质量。采用NAA诱导愈伤组织时，一般需要添加一定量的细胞分裂素。如：三裂叶野葛的叶柄和茎段外植体在含有6-BA 1.0mg/L和NAA 0.1mg/L的MS培养基上产生愈伤组织，愈伤诱导率分别为100%和94%。愈伤组织诱导中常用的细胞分裂素是6-BA、KT和TDZ，使用的浓度范围在0.01～10mg/L。6-BA是最为常用的细胞分裂素，能促进细胞分裂，有利于愈伤组织的形成；KT对愈伤组织诱导率的影响不大，但在诱导培养基中添加KT可以改善愈伤组织的质量，在一定程度上能延缓愈伤组织的衰老，延缓其器官分化能力的丧失，从而提高植株再生频率；TDZ具有很高的生物活性，其同浓度的诱导愈伤组织效力高于6-BA和KT，也容易诱导出胚性愈伤组织。在草木樨状黄芪愈伤组织诱导过程中，单独使用不同浓度的2，4-D，结果表明高浓度2，4-D（2mg/L）促进细胞脱分化的进程，从而使愈伤组织形成加快（表5-2）。在2，4-D浓度相同的条件下，当6-BA浓度增加到0.5mg/L时，愈伤组织的相对生长速率有较大幅度的增加（表5-3）。说明6-BA与2，4-D配合使用，似乎对愈伤组织形成没有明显促进作用。但加与不加6-BA，以及6-BA的使用浓度对愈伤组织进一步的生长速率有明显影响。

在愈伤组织诱导过程中，不同培养基种类、不同糖类、不同蔗糖浓度以及不同有机附加物诱导愈伤组织都有一定的影响。如非洲菊叶片愈伤组织诱导时，不同的基本培养基添加相同剂量的植物生长调节剂，MS基本培养基诱导愈伤组织的效果最好；而在ER、SH、B5和N6培养基上，叶片逐渐干枯死亡，不能诱导出愈伤组织。在剑麻愈伤组织诱导时，SH培养基对叶片愈伤组织诱导的时间快，出愈率高，愈伤量大，效果最好；NB培养基次之；N6培养基再次之；MS培养基最差。深入研究认为，培养基中低铵盐含量对愈伤组织的诱导有利；在含有较高浓度的盐酸硫胺素（VB1）的培养基中，愈伤组织的诱导率、愈伤组织的生物量有显著提高。

糖的种类和浓度影响到植物组织培养中愈伤组织的形成、生长和分化。不同植物、同一植物不同组织的细胞生长所要求的渗透压不同，对各种糖的降解利用能力也不同。常规植物组织培养中常添加3%蔗糖，油茶愈伤组织诱导时，以蔗糖、果糖、葡萄糖以及麦芽糖作为碳源，均可诱导出愈伤组织，且各碳源之间存在明显差异。其中蔗糖为碳源时，愈伤组织诱导率较高，分别达到100%和93.3%，其次为葡萄糖和麦芽糖，诱导率最低的为果糖，仅有57.5%。当蔗糖浓度升高到30g/L，愈伤组织诱导率达到100%，随着蔗糖浓度的继续升高，愈伤组织反诱导率而下降。但也有例外，如红掌愈伤组织诱导时，在相同的培养基上，添加葡萄糖的明显比添加蔗糖的愈伤组织诱导率高，两者相差达33.4%。苜蓿花药愈伤组织诱导时，9%蔗糖浓度下愈伤组织诱导率最高，但随着蔗糖浓度的提高而诱导率下降。但是，苜蓿花药愈伤组织在蔗糖含量为3%的诱导培养基上生长速度最快，愈伤组织疏松；随着糖浓度增加，愈伤组织生长缓慢，糖浓度为9%时，很多愈伤组织成为坚硬的球形。蓖麻愈伤组织诱导时，蔗糖在20～40g/L之间均有较高的愈伤组织诱导率，且随蔗糖浓度的增加而升高。

一般认为培养基pH为5.8时有利于植物的组织培养中愈伤组织的诱导。不同的材料也有其他报道。如杜仲愈伤组织诱导时，培养基在pH5.5以下时不利于愈伤组织的生长；培养基pH为5.5～6.5时对愈伤组织的生长具有促进作用；当培养基pH为6.5时，愈伤组织增长量最大；培养基pH为7.0时，随着培养时间的延长，愈伤组织逐渐失去光泽，生长缓慢。水稻花药培养中发现，将pH调至6.3～6.8，特别是在6.3时，愈伤组织的诱导率较pH为5.8时有大幅度提高。野葛愈伤组织诱导时，pH不同，愈伤组织诱导率和生长量有着显著的变化（图5-3）。

有机附加物常含有氨基酸、植物生长调节剂和蛋白质等成分复杂的营养成分和生理活性物质，补充一些未知的微量成分，促进细胞增殖和组织分化。如培养基中添加水解酪蛋白有利于胡桃楸胚性愈伤组织的诱导。但是也有研究表明，添加水解酪蛋白对黑莓愈伤组织诱导率和生长势的影响并不是特别明显，甚至水解酪蛋白浓度高于一定值时对于诱导愈伤组织有一定的抑制作用。

3．培养条件

培养条件主要指温度、光照。常规植物组织培养光照为800～2000lx，8～16h/d，（25±2）℃。对于愈伤组织诱导，因植物种类而改变光照。红掌愈伤组织诱导时无论哪个品种，暗培养的愈伤组织诱导率均显著高于光照培养。变温培养有利于红掌叶片愈伤组织的形成。更为重要的是经过变温处理的大部分愈伤组织表面颜色很快地转化为鲜黄绿色，呈现出较高的活性。而恒温培养的愈伤诱导率明显低于变温处理，而且愈伤组织需经过较长的时间才能转变成鲜黄绿色继续生长，部分叶片愈伤组织则丧失转变成黄绿色的能力，最终褐化，失去生长活性。马齿苋愈伤组织诱导时采用（30±1）℃、全光照，下胚轴愈伤组织诱导率达到100%。可能的原因是马齿苋属于C4植物、兼性CAM植物，其仅在30℃以上时萌发迅速，高光强全光照条件下生长旺盛。

二、芽诱导及增殖

以现存的芽（顶芽和腋芽）以外的任何植物器官、组织上通过器官发生重新形成的芽称为不定芽。而以植物茎尖或带有腋芽的茎段接种到培养基上进行培养，在植物生长调节剂作用下，打破顶端优势，促进腋芽生长，形成丛芽。这种以腋芽、顶芽、胚芽等定芽诱导形成的再生芽称为丛生芽。但也有学者将密集生长在一起呈丛生状的不定芽称为丛生芽。

1．芽诱导及增殖途径

采用顶芽或腋芽作为外植体，在含有较高细胞分裂素的培养基上培养，其顶芽或腋芽就会形成丛生芽，以后再分割为单芽或小的丛芽进行反复增殖培养，快速获得大量的丛生芽，经诱导生根即可获得成千上万的完整植株。这种增殖方式称为丛生芽增殖途径。理论上经过一年的培养，一个茎尖即可产生几百万乃至上千万株小苗。如香蕉组织培养，月增殖系数为4～5，一个吸芽在1年内可增殖数百万甚至上千万个芽。这种方法是目前应用最广泛的植物组织培养快速繁殖方法，适用于这种繁殖方法的植物种类也比较多，因为它不经过愈伤组织阶段而再生，是遗传性稳定的一种快速繁殖方式。此法增殖率高，但试管苗弱小，生根培养前常需要控制试管苗的分化数量和进行壮苗培养。

微型扦插也称为无菌短枝扦插繁殖（图5-4），该方法操作简便，适用范围广，试管苗移栽成活率高，但初期继代繁殖的速度较慢。

在植物组织培养中，不定芽的发生方式有两种：一种是从外植体表面直接分化出不定芽来，最终形成完整植株的途径，这种途径称为器官型不定芽途径，如裂叶秋海棠、非洲紫罗兰、百合、蓝猪耳等植物的培养。另一种途径是先从外植体上诱导出愈伤组织，再从愈伤组织上诱导出不定芽的间接器官发生过程，包括从愈伤组织或悬浮培养的细胞和原生质体再生植株。这种途径叫做器官发生型不定芽途径。这种途径再生的植株中发生变异的可能性较大，而变异频率太高会降低组培苗的商品价值。因此，不通过愈伤组织而直接形成不定芽的途径要更优越些。

不定芽增殖率明显比腋芽萌发率高。如裂叶秋海棠叶片诱导不定芽时，1cm2的叶片可以分化出150个芽。许多常规方法在植物组织培养条件下却能产生不定芽而形成再生植株，如松柏类植物。许多单子叶植物储藏器官能强烈地发生不定芽，用百合鳞片的切块就可以大量形成不定鳞茎，从而使繁殖率大大提高。需要注意不定芽或丛生芽诱导形成的培养物继代次数不能太多。当不定芽形成能力减弱时，或出现变异时，则需要重新建立培养物，以保持原有的遗传稳定性。

2．芽诱导及增殖的影响因素

在植物组织培养中，芽的诱导及增殖不仅受到植物自身遗传因素的影响，还受到培养基成分和培养条件的影响。其中，植物生长调节剂对芽诱导和增殖起着重要的调节作用。

芽诱导和增殖不仅与植物生长调节剂的种类有关，也与其组合及浓度有关。在植物组织培养中，细胞分裂素对芽诱导及增殖有着显著作用。如细胞分裂素6-BA和KT在同一浓度下对辣木的不定芽诱导存在着显著差异，总体上以6-BA对不定芽的诱导效果较好；同种植物生长调节剂不同浓度对不定芽的诱导也存在显著差异，且以0.5mg/L时效果最好，说明过高的细胞分裂素浓度对芽的增殖产生了抑制作用。可见，细胞分裂素6-BA对辣木不定芽的诱导效果较好，且低浓度的细胞分裂素有利于芽的诱导。在巴戟天继代培养中，增殖率主要受6-BA浓度的影响，丛芽的数量随着6-BA浓度的升高而增多，而且较高的6-BA浓度可以使形成丛芽的时间提前5～10d；比较不同6-BA浓度对增殖率的影响，结果表明，6-BA浓度为1.0mg/L时，单个外植体的最高增殖率为8.0个/块，平均繁殖系数为6.0/50d，芽苗健壮；6-BA升高至2.0mg/L时，单个外植体的最高增殖率达10.0个/块，平均繁殖系数为6.5/50d，芽苗下部叶片黄化。

细胞分裂素与生长素的配合对芽的形成和增殖有较明显的影响，二者比值较高，并且各自都在一定的极值范围内时，效果较好。细胞分裂素与生长素的组合中应用的生长素不仅对芽的分化有一定的影响，而且适当浓度的生长素能促进不定芽生长。在选择生长素时，IAA不稳定易分解，一般增殖培养时，最常用的是NAA和IBA。有时也添加GA，促进细胞伸长，对一些长势弱的品种适量加入可以促进植物的生长。如巴戟天增殖培养时，6-BA浓度固定，NAA或IBA浓度变化对增殖率有直接影响。NAA浓度为0.1～0.2mg/L时，增殖率为5.0；随着NAA浓度的升高，增殖率明显下降；当NAA浓度升到1.6mg/L，每块外植体只形成单一的芽。IBA在0.1～0.4mg/L之间，增殖率为6.0；随着浓度的升高，丛芽数量有所下降；当IBA浓度升到1.6mg/L时，每块外植体也能萌发4个新芽；高浓度的IBA与NAA均在一定程度上抑制芽苗长高。有研究发现，6-BA是影响“蓝心忍冬”不定芽诱导和增殖的主要因素，NAA对“蓝心忍冬”不定芽诱导和增殖的效果优于IBA，且随着NAA浓度的增加，不定芽诱导率和增殖系数均有所增加。在蓝猪耳不定芽诱导时，6-BA和NAA组合效果比单一使用6-BA好，表现为分化芽频率较高，叶片较厚，叶色深绿，但当NAA浓度过高时，分化芽的频率反而下降。辣木不定芽诱导时，6-BA/NAA的比值为10∶1时芽的繁殖系数最高，每个上胚轴平均能产生4.0个芽，6-BA/NAA比值越小，繁殖系数越低。在添加同一种生长素的处理中，细胞分裂素以6-BA效果较好，KT的效果较差。增殖培养时，细胞分裂素与生长素配合使用，在比值为10∶1时能有效促进不定芽的伸长，而且以绝对质量浓度低时不定芽的平均高度较大。辣木芽诱导与增殖单独使用6-BA 0.5mg/L即可，但是采用6-BA 0.1mg/L与NAA 0.01mg/L组合效果最好。

植物生长调节剂对芽诱导和增殖起着重要的作用。选择不定芽诱导率高的基因型、适宜培养条件和外植体来源对芽诱导及增殖有着直接的影响。如：以6个基因型的大豆为材料，研究了大豆不同基因型的不定芽诱导率、芽数和芽长情况。研究结果表明：大豆不定芽的产生对基因型具有依赖性，不同基因型之间存在明显差异。也有研究表明：紫苏不定芽诱导频率与品种基因型密切相关。在各外植体最适合植物生长调节剂组合及浓度下，子叶、下胚轴不定芽诱导率低，茎尖和真叶不定芽诱导率高。向日葵3种基因型不定芽诱导率有着明显的差异，不同外植体不定芽诱导率依次为子叶节＞下胚轴＞子叶＞真叶。在南烛（Vaccinium bracteatum Thunb.）组培苗离体叶片不定芽诱导研究时，基本培养基类型、植物生长调节剂种类及质量浓度、琼脂和蔗糖质量浓度、外植体类型、外植体接种方式和暗培养时间均对南烛离体叶片不定芽的出芽时间、再生率以及不定芽的生长状况有明显影响。这些研究表明，基因型的选择、外植体的来源和适宜培养条件等都是植物不定芽诱导不可忽视的重要因素。

三、胚状体诱导

1．胚状体的概况

在正常情况下，被子植物的胚是由合子（受精卵）发育而成，但在自然界中，少数植物胚珠的珠心或珠被细胞也可发育成胚状结构，并能够萌发长成幼苗。这种由植物胚囊外面的珠心细胞或珠被细胞直接经过有丝分裂而发育形成的胚状结构，被称为不定胚，又叫珠心胚。离体培养的植物细胞、组织或器官也能产生胚状结构。这种在植物组织培养过程中不经过受精过程起源于非合子细胞，经过多次细胞分裂所产生的一种与正常合子胚相似的结构称为胚状体。因此，胚状体具有以下含义：①它是器官、组织和细胞培养的产物，区别于自然界中无融合生殖产生的不定胚；②起源于非合子细胞，以区别于由受精卵发育形成的合子胚；③具有胚根、胚芽和胚轴的完整结构，并与外植体的维管束无联系，而区别于组织培养中的不定芽或不定根。

植物离体培养细胞产生胚状体的过程称为植物体细胞胚胎发生。植物体细胞胚胎发生形成胚状体的途径有直接途径和间接途径。前者是指从培养中的器官、组织、细胞或原生质体等外植体某些部位直接分化成胚；后者是指先诱导外植体产生胚性愈伤组织（即植物组织培养中外植体产生的具有胚胎发生能力的愈伤组织），再由胚性愈伤组织细胞分化形成胚。目前，多数胚状体的形成是通过间接途径产生的。胚状体在其形成的早期就具有根端（胚根）和茎端（胚芽），是一个完整植物体的雏形。可以通过根端（类胚柄结构）从外植体或愈伤组织中吸取营养，与培养材料的维管系统无直接连接，具有自己独立的维管系统，极易从外植体或愈伤组织表面分离，脱离培养材料后，在培养条件下可独立生长，形成新的植株。植物胚状体按外植体来源分为3大类：

（1）体细胞胚　来源于植物的根、茎、叶以及它们的组织和细胞，经离体培养而发生的类胚结构。其染色体组为两套，可发育成正常可育的植物体。

（2）生殖细胞胚　来源于大孢子和小孢子细胞（来源于小孢子的又称花粉胚），经离体培养而形成的类胚结构。染色体为单套，可发育成单倍性植物体，经染色体加倍后才能形成可育的植物体。

（3）三倍体胚　来源于胚乳细胞的胚状体，具有三套染色体组。如红江橙、枣、猕猴桃、杜仲的三倍体胚。由于三倍体植物具有不育性，因此就有可能建立起三倍体新类型，或以此产生无籽果实，或是利用其营养体生长优势。

由于胚状体具有繁殖快、单细胞起源、两极性等优点，因此，体细胞胚胎发生所产生的胚状体可为人工种子研制、单倍体育种、品种改良、优良种质的无性繁殖、植物转基因和突变体筛选等提供材料和技术基础。

2．胚状体诱导的影响因素

（1）外植体　胚状体诱导中外植体的筛选是成功的前提。理论上讲，植物体的各类器官，如根、茎、叶、花、种子都可以产生胚状体。然而胚状体诱导要获得成功不仅依赖于植物的基因型、外植体的类型，也跟外植体的生长发育、生理状态有很大关系。从植物胚状体诱导成功的实例看，所用的外植体有多种，大多是子叶、幼胚和幼叶，但也有以茎段、花药等为外植体。许多研究表明，材料的基因型是影响单倍体植株诱导率的关键因素，不同基因型植株对花药胚状体诱导率的影响不同。如5种不同基因型枸杞花药培养时，都可以诱导出胚状体，但是5种基因型的枸杞之间花药胚状体诱导率差异极显著。小白菜花药培养时，在供试的13个基因型中，有11个诱导形成了胚状体和植株，但不同基因型之间的小孢子胚诱导率相差极大，诱导率差异可达14倍。7种不同基因型的矮牵牛花药培养时，只有1个品种获得了胚状体，并一步成苗，而其他6个品种无任何反应。基因型影响体胚发生的原因可能是不同基因型的最适诱导条件不同，导致不同的胚状体诱导频率不同。在蓝桉的胚状体诱导中，以蓝桉成熟合子胚、子叶、下胚轴、叶子和茎段为外植体，研究发现成熟合子胚为外植体最有利于胚状体的诱导。在地中海蓝钟花叶片的诱导培养中，叶片的取材部位对诱导结果有一定的影响。靠近叶片基部较厚的叶片切块较易产生愈伤组织及胚状体的分化，叶尖部位的切块只能诱导出少量愈伤组织，无胚状体的产生。所以，在外植体处理时，一般选择生长健壮的叶片，而且在处理过程中将叶片靠近顶部1/3的部位切去，只选择剩下的2/3叶片作为外植体。刺五加胚状体诱导时，采用萌发15d以内的复叶叶柄外植体可以诱导出胚状体，诱导率取决于2，4-D和6-BA的质量浓度。因此，外植体的基因型、器官的种类以及生理年龄、接种方式等对胚性愈伤组织的诱导均有重要影响。

（2）植物生长物质　在胚状体诱导的早期阶段，植物生长物质的作用很重要。有些胚性取决于外植体，如柑橘、苹果等珠心组织，不需要诱导也能形成胚状体，但低浓度的生长素是促进其胚状体形成所必需的。诱导胚状体时，对于绝大多数植物而言，2，4-D都是诱导胚性愈伤组织必不可少的。在胚性愈伤组织形成后，应降低2，4-D的量或去除2，4-D；否则，胚状体便不能正常生长。因此，2，4-D的作用具有阶段性，在诱导胚性愈伤组织产生阶段通常起促进作用，而在胚性愈伤组织产生之后的胚状体分化发育阶段，则一般起抑制作用。细胞分裂素对多数植物胚状体诱导有一定的促进作用，但对于一些植物种类的胚性细胞诱导可能会起抑制作用或不起作用，合理地搭配生长素和细胞分裂素是胚状体的诱导关键之一。如人参培养时降低2，4-D的浓度能够诱导胚性愈伤组织的形成。胚性愈伤组织转入到去除2，4-D，只含细胞分裂素的培养基中培养，30d可产生大量的易分离的早期胚状体。转入MS基本培养基可获得再生植株。葱茎尖组织培养时，在6-BA浓度固定在2.0mg/L的条件下，添加1mg/L 2，4-D培养基上可诱导出愈伤组织；该愈伤组织在降低2，4-D浓度到0.5mg/L培养基上继代培养，继代3次，转变为胚性愈伤组织；在转入2，4-D仅为0.25mg/L的培养基上可诱导出胚状体。在植物组织培养过程中，噻苯隆（TDZ）既可以在愈伤组织诱导阶段起作用，也可以在体胚诱导、发育或萌发阶段起作用。许多难以再生植株的植物采用TDZ可成功地获得胚状体及再生植株。TDZ对植物诱导胚状体的作用因植物种类而异，它对胚状体诱导有促进或抑制作用，甚至对同一种植物不同栽培种的体胚发生，有的起促进作用，有的则起抑制作用。进一步研究表明TDZ对体胚发生的促进作用与浓度和处理时间有关。如在天竺葵胚状体诱导期间用10mmol/LTDZ处理3d，体胚发生率最高；TDZ浓度高于20mmol/L或处理时间长于3d都会严重地抑制体胚发生。虽然植物胚状体的诱导实验中，2，4-D和TDZ使用的最广泛，但2，4-D和TDZ并不是适宜于所有植物胚状体的诱导，或诱导效果就一定优于其他生长素类物质。

（3）培养基及培养条件　有研究表明，培养基种类、成分及培养条件对胚状体的诱导有一定影响。如蓝桉胚性愈伤组织转接到不含植物生长调节剂的MS、1/2MS、B5、DKW、WPM、JADS等培养基中，12周后胚性愈伤组织上不同程度地产生胚状体，MS培养基中获得最高胚状体发生率（30%），B5培养基中胚状体发生率为26%，1/2MS培养基中的为10%，JADS中的为8%，DKW中的为6%，而WPM培养基中的胚性愈伤组织不产生胚状体。在小白菜“丰乐上海青”花药培养中，10%蔗糖浓度有利于胚状体的诱导。当蔗糖浓度提高到13%时，胚状体诱导率较10%蔗糖下降了75%。此外，水解酪蛋白、麦芽提取物、椰乳的添加也会促进胚状体的发育。对赤桉胚状体诱导的研究中，在不同光照条件下，胚状体发生率有明显差异。当光照强度为20μmol/（m2·s）、光照时间为16h/d时胚状体诱导率最高，而暗培养时胚状体发生率较低。也有研究表明：尽管暗培养不能增加蓝桉胚状体诱导率和增殖率，但有利于胚状体质量的提高。因此，子叶诱导形成胚状体阶段之前外植体应该维持在黑暗中培养，然后再转移到光照下。

四、生根培养

试管苗生根培养是使无根苗生根的过程。生根培养的成功与否不仅直接决定了植物组织培养苗木生产的成败，而且生根状态对移栽的成活率及生长状况也有重要的影响。

研究表明，植物的组织培养根的发生都来自不定根。解剖学研究更进一步证明，试管苗不定根根原基是由愈伤组织、皮层、髓射线、维管射线和形成层等部位的细胞分化而成。根的形成从形态上可分为根原基形成和根原基的伸长及生长两个阶段。根原基的形成经历约48h；根原基的伸长和生长阶段快的需要3～4d，慢的则要20～30d。

试管苗的生根方法可分为试管内生根和试管外生根两种。试管内生根是最常见的植物组织培养获得再生植株的方式。当丛生芽增殖到一定数量后，及时转入生根培养基进行生根培养，即可形成带根系的再生植株。而有些植物种类在试管内生根困难；或者能够生根，但是根的维管束与茎的维管束无内在的联系；或有根而无根毛，移栽后不易成活。解决这些问题的最有效办法就是试管外生根。在油茶试管内生根培养中，不定根形成过程中伴随着大量的愈伤组织产生，消耗掉茎内的生根物质而呈老化状态，导致不能生根。而试管外生根苗的愈伤组织比较小，根原基从茎的维管束与形成层的交接处形成。瓶内生根一般1～2条根，且纤弱透明；而瓶外生根数一般为5～8根，根系发达，比较粗壮。另外，试管外生根也是一种降低生产成本的有效措施，不仅可以减少无菌操作的工时消耗，还减少了培养基制作的材料与能源。可见，采用瓶外生根的方法，把生根和驯化过程结合起来，既可大幅度降低成本，又可提高移栽成活率，这在蓝莓、栀子花、满天星、核桃、树莓等植物上应用已获得了成功。

生根和移栽是决定能否进行植物组织培养大量生产和应用实际的关键环节，而如何提高试管苗的生根和移栽成活率就成为了工厂化育苗主要研究的任务之一。

影响试管苗生根的因素很多，有培养材料自身的生理生化状态的影响，还受到培养基成分和培养条件的影响。

（1）培养材料自身的生理生化状态　诱导生根是由植物基因控制的，不同基因型的外植体诱导生根难易不同。如观赏型北美红杉较用材型生根效果好；杉木不同优良无性系之间生根效果存在较大的差异。一般不同植物生根的规律是：木本植物比草本植物难，成年树比幼年树难，乔木比灌木难。如1年生桉树的插条易生根，但5年生的插条则不能生根。

（2）培养基成分也是影响试管苗生根的重要因素　植物组织培养生根阶段，降低培养基中大量元素的浓度，可提高大多数植物的生根能力。所以在生根培养时，多采用1/2MS、1/4MS培养基或White培养基，不加植物生长调节剂或者只加入适量的生长素。如需添加生长素，多数以IBA、IAA、NAA单独或配合使用，它们具有明显的促进不定根和侧根发生和生长的作用。其中最常用的是NAA和IBA，浓度一般为0.1～10.0mg/L。因生长素具“双重作用”，即在较低质量浓度下生长素可促进生长，在高质量浓度下对生长有抑制作用。如蝴蝶兰生根培养中，随着NAA浓度的升高，生根率不断增加，当NAA为0.8mg/L时，生根率达到100%，且试管苗的茎叶生长良好。当NAA浓度高于1mg/L时，生根率降低，根及茎叶生长的各项指标随NAA浓度的增加呈下降趋势。一般而言，赤霉素、细胞分裂素和乙烯通常不利于生根。培养基中添加椰子汁、香蕉泥后可改善试管苗根及茎叶生长状态。在蝴蝶兰生根培养中，生根效果以添加50mL/L椰汁＋50g/L香蕉泥的处理分化的根数多，根较长且粗，茎叶生长旺盛。单独添加100g/L香蕉泥的处理组生根率最高，达到100%，说明香蕉泥具有生根壮苗的作用。培养基中的蔗糖，一方面为培养物的生长和发育代谢提供所需的能量和底物，另一方面也影响培养基的渗透势。培养基的渗透势又反过来对培养物的代谢起到调节作用。为了使生根小苗健壮生长利于移栽，生根培养基中的蔗糖用量可适当减少，用1.5%～2%的浓度，以减少试管苗对异养条件的依赖；同时提高光照强度，改善光质，促进光合作用。如蝴蝶兰生根诱导阶段，采用红∶蓝∶远红＝3∶6∶1的LED组合，其根长及根系活力均较对照显著增加。而有些植物生根培养过程中根原基的形成和生长需要弱光或黑暗条件。活性炭（AC）可起到遮光的作用，提供生根的暗环境，吸附植物生长调节剂与其他有利生根的物质，防止褐变。所以在一些生根培养基中添加适宜浓度（0.1%～0.5%）的活性炭有利于生根。甚至有些植物生根过程需要好的通气状态，因此在培养基中添加蛭石、珍珠岩等填充料来改善通气状态。如番木瓜丛生芽在生根培养基中先暗培养1周后，再转接至添加蛭石的生根培养基，3周后生根率达90%以上，根系发达，形态正常，可形成完整的组培苗。另外，丛生芽如果一直在不添加蛭石的生根培养基上连续培养，也能诱导出根，根粗壮、膨化、根系不发达，并且有愈伤化现象。在油茶生根培养基中添加不同量的珍珠岩后，随着培养基中珍珠岩含量的增加，生根率先升后降，当珍珠岩为50g/L时，生根率可达95.83%，比未加珍珠岩的生根率提高了2.6倍，且生根数及平均根长都显著增加，根系均深入培养基里面，更有利于后期的炼苗移栽。