3.3 实验技术
3.3.1 样品的制备
样品制备要求基本与紫外-可见吸收光谱样品制备要求相同。但样品中荧光物质、溶剂和溶质分子之间往往存在相互作用，使荧光强度降低或与浓度不呈线性关系。上述现象称为荧光猝灭。发生荧光猝灭的原因有以下几点。
①荧光物质与能引起荧光猝灭的其他物质（即荧光猝灭剂）碰撞造成能量损失；
②荧光物质与猝灭剂作用生成了不发光的配合物；
③荧光物质中加入溴化碘后易发生无辐射去活化过程；
④荧光物质发生自吸收或聚合；
⑤溶解氧引发的氧化或促进无辐射去活化过程。
溶剂对样品中荧光物质的荧光强度影响表现为：溶剂极性增大使荧光波长向高波长方向移动，强度增强；溶剂黏度减小，分子间碰撞机会增加，无辐射跃迁机会增加，导致荧光减弱；溶剂与荧光物质形成化合物或溶剂改变荧光物质的电离状态。每种荧光物质都有适合的pH范围。
3.3.2 荧光分析新技术
在实验中，除了前面讲到的荧光光谱技术，还包括时间分辨发光光谱技术、同步扫描技术、三维荧光、固体表面荧光测定等新技术。
（1）时间分辨发光光谱技术
时间分辨发光光谱技术是基于不同发光体的发光衰减速率的不同，配置带时间延迟设备的脉冲光源和带有门控时间电路的检测器件，通过选择延迟时间td和门控时间tg，对发射单色器进行扫描，得到时间分辨发射光谱，从而实现对光谱重叠但发光寿命不同的组分的分辨和分别测定。也可以固定激发波长与发射波长，对门控时间进行扫描，得到发光强度随时间的衰减曲线，从而实现发光寿命的测量。
（2）同步扫描技术
根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的关系，同步扫描技术可分为固定波长差、固定能量差和可变角（可变波长）同步扫描。同步扫描技术具有光谱简化、谱线窄化、分辨率提高、光谱重叠减少、选择性提高、散射光影响减少等诸多优点。
同步荧光光谱分析法是提高分析选择性、解决多组分荧光物质同时测定的良好手段之一。
（3）三维荧光
普通荧光分析所测得的光谱是二维谱图，包括固定激发波长、扫描发射波长所获得的发射光谱，及固定发射波长、扫描激发波长所获得的激发光谱。但是，实际上荧光强度应是激发波长和发射波长这两个波长变量的函数。描述荧光强度随激发波长、发射波长变化的关系图谱，即为三维荧光光谱。
由于三维荧光光谱反映了发光强度随激发波长和发射波长变化的情况，因而能提供比常规荧光光谱和同步荧光光谱更完整的光谱信息，可作为一种很有价值的光谱指纹技术。
（4）固体表面荧光测定
固体表面荧光测定有两种方法：一种是直接测定固体物质表面的荧光；另一种是将待测组分吸附在固体物质表面，然后进行荧光测定。采用的固体物质品种众多，有硅胶、氧化铝、滤纸、硅酮橡胶、乙酸钠、溴化钾、纤维素等。
固体表面荧光测定常与薄层色谱法或高效薄层色谱法联合使用。样品点滴在薄层色谱板上，经分离后对各个组分进行荧光强度的测定以及荧光发射光谱和荧光激发光谱的测绘。用样品的荧光强度和标准物质的荧光强度对比可以进行定量分析。