根据国际细胞治疗协会提出的“间充质干细胞的标准”，从脐带分离获得的细胞是不是间充质干细胞，必须从细胞生长特性、形态学特征、免疫表型标志、分化潜能甚至生物学功能等诸多方面检测鉴定。

运用改良的MTT法，通过比色来检测脐带间充质干细胞的活性，并绘制生长曲线，计算出群体倍增时间。

MTX检测试剂盒、96孔组织板、酶标仪。

取对数生长期的脐带间充质干细胞，胰酶消化成单细胞悬液，PBS离心洗涤三遍后，计数，按照2×10 ³/孔接种96孔板，100μl/孔，置于5%CO ₂、37℃的培养箱中静置培养。每隔24小时，每孔加入20μl MTS孵育2小时后，用酶标仪（490nm）测定各孔吸光度值，连续观察10天后，以时间为横轴，吸光度值为纵轴绘制生长曲线。

标准的生长曲线近似S形，细胞刚接种前2天处于滞留期，增殖不明显；3~7天进入对数增殖期，细胞生长旺盛，活力最佳；第8天进入平台期。在生长曲线上细胞数量增加一倍时间为细胞倍增时间，可以从生长曲线上面换算出，细胞倍增时间即细胞对数生长期，按照细胞倍增时间计算出群体倍增时间（DT）。DT=T×［lg2/lg（Nt2/Nt1）］，T代表生长曲线中的对数增殖时间段（t2~t1），Nt1是对数增殖期起始时间拐点的细胞数，Nt2是对数增殖末期的细胞数。

细胞内的DNA含量随着细胞周期进程发生周期性的变化，利用PI标记的方法，利用流式细胞仪，将待检测的脐带间充质干细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下细胞排成单列进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，可以分析出细胞的DNA的含量以及各周期各时相的百分比（图6-1）。

流式细胞仪、离心机、水浴、冰箱、70%乙醇（保存于4℃），RNase-A（-20℃保存）、PI、PBS。

分别取三组对数生长期的脐带间充质干细胞，胰酶消化成单细胞悬液，每管各1×10 ⁶个，PBS洗涤2次，用力打入5ml 70%（预冷）乙醇中，封口膜封口4℃过夜。PBS洗2次，用0.4ml的PBS重悬并转至Tube中轻轻吹打，加入RNase-A约3μl，水浴消化30分钟，加PI约50μl，在水浴中避光染色30分钟后流式细胞仪进行检测。通过Multcycle-AV 软件记录分析细胞周期结果。实验重复3次，取平均值。

细胞周期分析表明，80%的细胞处于G0~G1期，表明脐带间充质干细胞有丝分裂旺盛，增殖能力强。

在倒置相差显微镜下，可以观察到原代培养的细胞少数长梭形贴壁生长的细胞组织块周围爬出（图6-2A），逐渐发展到围绕组织块呈克隆状生长（图6-2B）。传代后可以观察到大量成纤维细胞样细胞呈漩涡状密集排列生长（图6-2C），呈现明显的方向性（图6-2D），显示出典型的细胞形态特征。

总之，UCMSC生长特性及细胞形态特征反映了其生物学特性，如果细胞培养过程中出现生长贴壁困难，生长速度缓慢，胞体增宽并在细胞内有较多黑色颗粒或脂肪滴，甚至出现凋亡小体或上清液中有较多细胞碎片，表明细胞老化和细胞活性较差（图6-3），不宜用于实验研究。

间充质干细胞表型标志鉴定是细胞质量鉴定的核心内容，是直接决定细胞究竟是不是间充质干细胞的判定标准之一。UCMSC可表达多种抗原标志蛋白分子，4~8代的 UCMSC表面标志较为稳定，可表达CD10、CD13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166及MHC-Ⅰ等细胞标志，低量表达移植相关的表面标记CD80、CD86和HLA-ABC，不表达 CD14、CD31、CD33、CD34、CD45、CD56及HLA-Ⅱ类分子，也不表达共刺激分子，可以逃逸异体的T淋巴细胞和NK细胞的识别而在异体甚至异种体内长期存活。这些特性为它们作为组织工程的种子细胞提供了强大的理论根据，为自身免疫性疾病、器官移植及各种替代治疗方面的潜在应用价值提供了有力的支持。UCMSC的免疫表型分析主要采用流式细胞分析术，也可采用免疫细胞化学染色法。这里主要介绍流式细胞分析术。

采用流式细胞分析术对UCMSC进行表型分析的基本原理是根据UCMSC表达于细胞表面的标志分子，选取相应的荧光标记抗体进行特异性结合反应，然后通过流式细胞仪进行分类计数，从而计算出表达某种特定标志分子的细胞数量和比例。由于UCMSC缺乏特异性的表面标志分子，不能以单一的标志分子作为判定指标，需要选取一组或系列分子标志物作为检测指标，根据多种标志物的表达情况进行综合判定。对UCMSC进行表型分析，实际上也是评价其是否具有干性和检测其纯度。基本方法是通过加入荧光标记的表面标志物抗体孵育后，应用流式细胞仪检测表面抗原情况。比如在人UCMSC表型分析中，常用的阳性标志分子有：CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166 及MHC-Ⅰ，阴性标记常选用CD45和CD34等。

流式细胞仪、荧光标记抗体、磷酸盐缓冲液。

取体外培养的第三代（P3）的UCMSC，弃除培养基，胰酶消化，生理盐水离心洗涤3次，计数活细胞，稀释并分装于孵育反应管中，1×10 ⁶个细胞/管，分别加入CD29-FITC、CD34-PE、CD44-FITC、CD45-PC5、CD90-FITC、CD105-PE和同型对照10μl，4℃避光孵育30分钟，磷酸盐缓冲液洗涤弃除未结合抗体后，按照流式细胞仪的操作程序进行表面抗原标志分子的表达分析。

采用流式细胞分析技术表明脐带间充质干细胞CD90、CD29、CD105和CD44呈阳性，阳性率不低于95%，CD45和CD34呈阴性，表达不高于2%，且同型对照均为阴性，从脐带分离出来的原代细胞P0通过传代除去杂细胞后，P3的阴性标志的细胞越来越少，而阳性标志的细胞越来越多，脐带间充质干细胞得到纯化（图6-4）。

同型对照均为阴性的情况下所得到结果才真实可靠。

从干细胞的定义可知：干细胞的一个独特生物学特性就是具有分化潜能，这也是其用于疾病治疗和发育生物学研究的价值所在。UCMSC在体内特定的组织微环境或体外特定的诱导培养条件下，可以分化为脂肪、骨、软骨等组织细胞，公认的UCMSC分化潜能鉴定标准就是诱导向脂肪、骨和软骨细胞分化，以便鉴定UCMSC是否具有多向分化能力。

脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基A液基础培养基175ml、胎牛血清20ml、双抗2ml、谷氨酰胺2ml、胰岛素400μl、3- 异丁基 -1- 甲基黄嘌呤 200μl、罗格列酮 200μl、地塞米松 200μl。

脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基A液基础培养基175ml、胎牛血清20ml、双抗2ml、谷氨酰胺2ml、胰岛素400μl。

油红O、六孔板、PBS、中性甲醛。

（1） 当培养的脐带间充质干细胞融合度达到80%~90%时，胰酶消化收集。

（2） 将消化下来的细胞按照2×10 ⁴cells/cm ²的细胞密度接种在六孔板中，将细胞置于37℃，5% CO ₂的培养箱中进行培养。

（3） 每隔3天换液，直到细胞融合度达到100%或者过融合。建议选择过融合状态的细胞做成脂诱导分化鉴定。

（4） 小心的将间质干细胞完全培养基吸走，向六孔板中加入事先配好的2ml脐带间质干细胞成脂诱导分化培养基A液。

（5） 诱导3天后，吸走六孔板中的A液，加入2ml脐带间质干细胞成脂导诱分化培养基B液。

（6） 24小时后，吸走B液，换回A液进行诱导。

（7） A液和B液交替作用3~5次后（12~20天），继续用B液维持培养4~7天直到脂滴变得足够大、圆。B液维持培养期间，每隔3天需要换用新鲜的B液。

（8） 成脂诱导分化结束后，吸走六孔板中的成脂诱导分化培养基，用PBS冲洗1~2次。每孔加入2ml 4%中性甲醛溶液固定30分钟。

（9） 吸走中性甲醛溶液，用PBS冲洗2次。每孔中加入1ml油红O染料工作液染30分钟（工作液配制方法：油红O贮存液∶蒸馏水=3∶2，混匀后用中性滤纸过滤即可）。

（10） 吸走油红O染液，用PBS冲洗2~3次。

（11） 将培养板置于显微镜下观察成脂染色效果，并拍照。

脐带间充质干细胞经过成脂分化诱导后，经油红O染色，可见明显红色脂滴（图6-5）。

脐带间质干细胞成骨诱导分化基础培养基175ml、胎牛血清 20ml、双抗 2ml、谷氨酰胺 2ml、抗坏血酸 400μl、β- 甘油磷酸钠 2ml、地塞米松 20μl。

茜素红染液、六孔板、明胶、PBS、中性甲醛。

（1） 明胶包被：加入足量的0.1%的无菌明胶溶液，使之覆盖整个六孔板，室温放置30分钟以上，使用前尽量吸去明胶溶液。在洁净工作台中打开盖子，让残留的明胶溶液全部风干（不超过30分钟）。

（2） 当培养的脐带间充质干细胞融合度达到80%~90%时，胰酶消化收集。

（3） 将消化下来的脐带间质干细胞按照2×10 ⁴ cells/cm ²。的细胞密度接种在事先包被0.1%明胶的六孔板中。将细胞置于37℃，5% CO ₂的培养箱中进行培养。

（4） 当细胞融合度达到60%~70%时，小心的将孔内完全培养基吸走，向六孔板中加入2ml事先配置好的脐带间充质成骨诱导分化培养基。

（5） 每隔3天换用新鲜的成骨诱导分化培养基。诱导2~4周。

（6） 成骨诱导分化结束后，吸走六孔板中的成骨诱导分化培养基，用PBS冲洗1~2次。每孔加入2ml 4%中性甲醛溶液固定30分钟。

（7） 吸走中性甲醛溶液，用PBS冲洗2次。每孔中加入1ml茜素红染液染3~5分钟。

（8） 吸走茜素红染液，用PBS冲洗2~3次。

（9） 将培养板置于显微镜下观察成骨染色效果，并拍照。

脐带间充质干细胞经成骨诱导分化后，诱导形成的钙质结节可被茜素红染成红色（图6-6）。

脐带间质干细胞成软骨诱导分化基础培养基 175ml、抗坏血酸 600μl、ITS 添加物 2ml、TGF-β ₃ 2ml丙酮酸钠 200μl、脯氨酸 200μl。

阿新蓝染液、15ml离心管、PBS、中性甲醛。

（1） 当培养的脐带间充质干细胞融合度达到80%~90%时，胰酶消化收集。

（2） 对消化后的细胞计数，将计数后的细胞转移到15ml离心管中。

（3） 调整为7.5×10 ⁵cells/ml的密度重悬间质干细胞，室温下150g离心5分钟，吸去上清。

（4） 用成软骨诱导完全培养基按照5.0×10 ⁵cells/ml的密度进行重悬。

（5） 吸取0.5ml（2.5×10 ⁵cells）细胞悬液转移到15ml离心管中，室温下150g离心5分钟。此步骤不需要吸掉上清并重悬细胞。

（6） 拧松离心管盖以便于气体交换，将其放置于37℃，5% CO ₂的培养箱中培养。24小时内不要摇动离心管。

（7） 每隔2~3天需要给细胞换用新鲜的成软骨诱导分化完全培养基（为防止软骨球在换液时被吸出，建议在吸管前段加上一个1~200μl的枪头），每管0.5ml。

换液之后，轻弹离心管底部使软骨球脱离管底悬浮在液体中。拧松离心管盖放入37℃，5% CO ₂培养箱中培养。

（8） 诱导培养14~28天。对软骨小球进行甲醛溶液固定和石蜡包埋，进行阿新蓝染色并拍照。

脐带间充质干细胞经成软骨诱导分化后，分化形成的软骨胶原基质被阿甲新蓝染成蓝色（图6-7）。

事实上，不断深入的基础研究证实：UCMSC在体内特定的组织微环境或体外特定的诱导培养条件下，可以跨胚层分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，这种强大的分化潜能使其成为组织工程再造的最佳候选者。虽然按照国际细胞治疗协会提出的“间充质干细胞的标准”，确定细胞可以诱导向脂肪、骨和软骨细胞分化，就可以鉴定是UCMSC了，但这只能说明其具有多向分化能力，没有体现其跨胚层分化能力，因此建议在此基础上增加向神经、胰岛等多胚层组织细胞分化潜能分析。

1.取体外传代培养至第3代的人脐带间充质干细胞，用6孔细胞培养板和完全培养基进行传代培养，带细胞生长密度达到70%时开始进行诱导培养，设3个复孔，同时设对照孔。

2.吸管吸出培养液，加入复方电解质衡液3ml，轻轻晃动使死细胞及细胞碎片漂浮，然后吸除上清液，反复2次。

3.加入诱导培养基进行诱导培养。诱导培养基：无血清neurobasal培养基，含2%N2/B27，10ng/mlEGF，10ng/mlbFGF。

4.置于5%CO ₂、温度37℃、饱和湿度的细胞培养箱中进行静置诱导培养，每3天按上述浓度补充诱导因子1次，每6天换1次培养液，连续18天，动态观察细胞形态变化。

5.更换培养液为神经元细胞诱导培养基，培养体系为：含5%胎牛血清的DF12培养基添加诱导因子，10ng/mlEGF，10ng/mlbFGF，10μM Forskolin，0.5μM 全反式维 A 酸，0.1mM IBMX，10ng/mlBNDF。

6.置于5%CO ₂、温度37℃、饱和湿度的细胞培养箱中进行静置诱导培养8天，每3天换1次液，观察细胞形态学变化并拍照记录。

7. 用 Nestin、NeuroD1、MAP2、NF-M单 克隆抗体对诱导细胞进行免疫组织化学染色。方法：用吸管去除培养液→PBS漂洗3次→4%甲醛固定30分钟→用兔血清封闭→加入一抗（NES和MAP 1∶50，NeuroD1和NF-M 1∶100）→于4℃条件下浮育过夜→加入PICT标记二抗→于室温条件下浮育30分钟→光学显微镜下观察并拍照记录（图6-8）。

1.取体外传代培养至第3代的人脐带间充质干细胞，用6孔细胞培养板和完全培养基进行传代培养，带细胞生长密度达到70%时开始进行诱导培养，设3个复孔，同时设对照孔。

2.管吸出培养液，加入复方电解质衡液3ml，轻轻晃动使死细胞及细胞碎片漂浮，然后吸除上清液，反复2次。

3.加入诱导培养基3ml，培养体系为：高糖DMEM基础培养基、10%胎牛血清、10ng/ml bFGF、1μmol/mlβ- 巯基乙醇。

4.诱导培养7天。

5.更换为含 10% 胎牛血清、20ng/ml bFGF、20ng/L EGF，1μmol/mlβ- 巯基乙醇、10μmol/ml尼克酰胺的高糖DMEM培养基，继续培养6~7天。

6.insulin和C肽表达分析　将诱导好的细胞用4%多聚甲醛固定10分钟→加入3%H ₂O ₂→静置5分钟→PBS冲洗5分钟×3次→在标记好的孔中分别加入鼠抗人insulin和C肽抗体→4℃过夜→PBS冲洗5分钟×3次→滴加荧光二抗→37℃孵育20分钟→用PBS洗涤5分钟×3次→光镜下观察并排照记录。

7.特异性基因Pdx/1、NeuroD1、Ngn/3转录分析　设计、合成引物，购买反转录PCR试剂盒，提取总RNA，按试剂盒操作说明书的操作程序进行实验，将RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板进行PCR反应，凝胶成像系统观察并拍照记录。本实验室设计引物如表6-2所示。

8.诱导培养过程中每2天1次在倒置相差显微镜下动态观察细胞生长和形态变化并拍照记录（图6-9）。

除了上述体外跨胚层多向分化潜能鉴定之外，UCMSC还具有十分突出的免疫调节和自分泌功能，这在更多时候其实才是UCMSC最主要的生物学功能及临床应用价值所在，因此，这些内容也应该成为UCMSC质量鉴定的重要指标，而不是之一。

通常将UCMSC与外周血淋巴细胞按一定比例（1∶5、1∶10、1∶20、1∶40）进行体外共培养3天后，检测淋巴细胞亚群比例的变化，结果T细胞的增殖率下降50%以上，调节性T细胞比例增加20%以上，CD8 ⁺细胞比例降低，培养上清中的干扰素（IFN-γ）含量下降。

异体来源的脐带间充质干细胞通过分泌可溶性的细胞因子，对人T淋巴细胞具有抑制作用。抑制作用与脐带间充质干细胞的数量呈正比。

外周淋巴细胞分离液、六孔板、Transwell隔离培养板、PHA、MTS检测试剂盒。

（1） 选择生长良好，细胞融合度达80%~90%的脐带间充质干细胞，胰酶消化后离心计数。

（2） 按照2×10 ⁵cells/ml的细胞密度接种在六孔板中，并置于37℃，5% CO ₂的培养箱中培养。

（3） 用外周血淋巴细胞分离液通过密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，用贴壁法分离得出T淋巴细胞，并计数。

（4） 待脐带间充质干细胞贴壁后，按照UCMSC：外周血T 淋巴细胞为 1∶1、1∶5、1∶10、1∶20的比例在Transwell隔离的上层加入T细胞。每孔加入200μlPHA刺激。置于37℃，5% CO ₂的培养箱中培养。

（5） 脐带间充质干细胞和外周血T淋巴细胞共培养72小时后，把T淋巴细胞移入96孔板中，每孔加入20μl MTS孵育2小时后，用酶标仪（490nm）测定各孔吸光度值。

（6） 根据吸光度值来判断T淋巴细胞的活性。

在PHA的刺激下，T淋巴细胞的活性随着脐带间充质干细胞的数量增加而逐渐减弱。

采用兔或灵长类急性关节炎模型进行评价，给动物模型通过静脉输入1×10 ⁶细胞/kg，隔日1次，连续3次，结果显示关节红肿消失，病理组织观察可见关节组织中浸润炎性细胞减少，关节液内的IL-1、TNF-α等炎性细胞因子含量降低。

UCMSC分泌数量众多的可溶性生物活性因子和外分泌体，通过检测培养上清中的这些活性因子和外泌体含量可初步判定UCMSC的自分泌功能。外泌体的组成成分相对复杂，关于不同细胞产生的外泌在组成、结构与功能方面的差异尚为完全阐明，一般检测UCMSC的分泌功能分析以检测可溶性生物活性因子为主，重点是有选择性地检测促细胞生长类因子的含量。UCMSC在体外无血清培养体系中或生理盐水培养24小时后，培养上清中新出现有多种涉及细胞生长、分化及免疫调节相关的可溶性生物活性因子，其中涉及促进细胞生长的因子有干细胞生长因子（SCF）、神经生长因子（NGF）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、肝细胞生长因子（HGF）、骨形成蛋白（BMP）、白介素类（IL）、转化生长因子（TGF）等，可选择性地检测培养上清中的3~5种有代表性的生长因子的含量，作为判定UCMSC自分泌功能的指标，也可根据实际情况进行蛋白质组学分析，全面评估UCMSC的自分泌功能。