脐带间充质干细胞的体外扩增是利用其贴壁生长特性，通过传代培养不仅可以纯化间充质干细胞，而且可以使细胞数量不断增多，从而满足临床治疗和科学研究的数量需求。脐带间充质干细胞在贴壁培养过程中，随着细胞分裂增殖逐渐在瓶底形成一个密集的细胞层，细胞之间因为接触性抑制作用和瓶壁面积限制，细胞会停止生长、脱落，此时需要进行传代培养，即通过酶消化法收集细胞并稀释成低密度悬液后接种于新的培养体系中继续培养。体外扩增培养的意义不仅使脐带间充质干细胞的数量越来越多，而且通过传代培养可以起到纯化细胞的作用，使一些为数稀少的杂细胞在扩增过程中逐渐减少而被淘汰，也可以利用差速贴壁、消化强度、生长速度差异、克隆培养等传代处理方法和处理强度去除杂细胞，从而达到纯化脐带间充质干细胞的目的。该细胞的贴壁性能好，生长速度快，体外扩增相对容易，其难点是在数量扩增的同时要维持其干细胞的自我更新和多向分化特性，即“干性”。提高UCMSC体外扩增效率的方法主要有设法增加贴壁面积和优化培养体系等。增加贴壁面积的方法很多，主要有：①采用微球培养；②将细胞置于中空纤维系统中培养；③多层培养瓶（细胞工厂）培养；④微孔材料培养体系。促进UCMSC生长的方法主要是在培养体系中添加bFGF、FGF等促生长的因子，提高血清浓度或增加营养成分等，本实验室发现添加HLA-B27、卵细胞提取物可显著提高UCMSC的生长速度。维持UCMSC的“干性”主要通过添加干细胞生长因子（SCF）等维持因子。UCMSC体外长期传代培养具有自动向脂肪细胞分化的倾向，如果不添加干细胞维持因子，一般在体外传代培养3个月后生长活性、分化潜能显著降低，细胞处于衰老状态，细胞内出现脂肪滴。在本实验室建立的培养体系中，UCMSC传代培养8代以内生长良好，可维持其“干性”不变。鉴于UCMSC的来源丰富，体外扩增相对容易，具有规模化生产和产业化的可行性，临床应用范围广，建立UCMSC的高效扩增技术并维持其“干性”一直是UCMSC开发研究的重点课题之一。随着培养体系的不断优化，新型培养基的研究进展和添加因子的发现，脐带间充质干细胞的体外扩增效率还将逐渐提高，一条脐带一个工厂的目标有可能实现。在本实验室的脐带间充质干细胞扩增体系中，一条长50cm的脐带，体外扩增至第8代即可满足上万人治疗用（表5-1）。

在UCMSC的研究与应用领域，如何高效获取足够数量的UCMSC并保持其生长活力和功能是人们关注的关键技术问题之一。目前从人脐组织中分离提取UCMSC主要有酶消化法和组织块贴壁培养法，其中酶消化法有单酶消化（胶原酶、Ⅰ型胶原酶、Ⅳ型胶原酶）、双酶消化（胶原酶联合胰酶）、三酶消化（胶原酶联合透明质酸酶）法等，也有五联消化法的报道（Ⅰ型胶原酶、Ⅳ型胶原、透明质酸酶、胰酶、DNAase）。研究者认为多酶联合消化可以提高带间充质干细胞的获得率和缩短酶消化时间，减少酶消化对细胞活性的影响。随着技术方法的不断改进，人脐带间充质干细胞的获得率已经从1×10 ⁴细胞/cm提高到了1×10 ⁶细胞/cm，效率提高了上百倍，但与组织中脐带间充质干细胞的实际含量和理论值差距甚远，在分离制备时间和数量上还有较大的提升空间。传统制备方法存在的主要问题是：①脐带间充质干细胞存在于脐带的黏膜组织中，组织中含有胶原、透明质酸、黏多糖、结缔组织、基质细胞、成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞等。华尔通胶由胶原纤维骨架和存在于其间的蛋白多糖组成，其中含有Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ四种胶原纤维分布，而Ⅳ型胶原占70%以上。蛋白多糖中含量较高的是透明质酸，含量也在70%左右。脐带组织中含有多种细胞外成分，传统的酶消化难以充分消化脐带间充质干细胞周围的连接成分，不利于间充质干细胞游离，材料浪费较大。②酶消化法缺乏统一的标准，提高消化酶的含量或延长消化时间可能对细胞造成损伤，对细胞生长活性有较大影响。③酶消化后会有大量的死细胞、细胞碎片和酶解物，这些成分会导致间充质干细胞贴壁和生长缓慢，影响细胞周期。④酶消化会破坏间充质干细胞的表面分子影响间充质干细胞接受周围信息及信号转导，从而影响细胞生长和“干性”维持。因此，针对脐带组织成分，采取多酶联合消化法，优化酶消化组合和消化方法，充分释放间充质干细胞，是值得进一步研究的关键技术之一。组织块贴壁培养法主要是利用间充质干细胞的贴壁生长特性使其从组成中自然爬出并沿组织周围延伸生长，该方法避免了酶消化对细胞的损伤，但该方法需要对组织进行机械分散处理，容易导致细胞死亡和出现大量组织或细胞碎片，导致培养系统的黏稠度增加，不利于细胞生长，同时由于间充质干细胞需要从组织中自然延伸生长，只有分布在组织边缘的细胞容易生长，而处于组织深部的细胞则难以暴露和游离生长。组织块贴壁培养法的关键是首先要尽可能将组织分离成小块，一般应在1mm ³以下。其次是通过自然沉降或离心洗涤法去除杂质，排除死细胞、细胞碎片及游离组织成分对组织块贴壁和细胞生长的影响。令组织块充分贴壁是间充质干细胞生长的先决条件，应设法使组织块能够均匀分布于培养瓶底和充分贴壁，主要措施是在接种初期只加少量培养液，让全部组织块有接触瓶壁的机会，待其贴壁牢固后在补加新培养液。减轻组织分散强度，减少机械损伤，提高细胞的游离空间，增加贴壁空间和面积是提高脐带组织利用率和间充质干细胞获得率的重要措施。组织反复培养法是本实验室长期摸索后建立起来的脐带间充质干细胞高效培养技术，在优化组织块制备和培养体系的基础上，通过组织反复贴壁培养法，大大提高了脐带组织的利用率和原代间充质干细胞的获得率，每个组织块可反复培养3次以上，与单次培养相比，可提高原代间充质干细胞的获得量3倍以上。

脐带间充质干细胞在体外传代扩增体系中增殖速度比原代快，一般6天左右即可达到85%~90%融合，在本实验室连续传代培养UCMSC，至少在8代以内并未显著降低其活性，如果在培养细胞中添加“干性”维持因子和促生长因子等可继续传代而维持其活性。目前，脐带间充质干细胞体外扩增中比较稳定的方法仍然是贴壁传代培养法，实际上采用该方法已经完全可以满足“一条脐带，一个工厂”的技术需要，因为结合低温冻存技术，一条脐带可制备出满足数万人临床治疗需要的标准化细胞产品。采用细胞工厂（多层培养瓶）可显著提高扩增效率，其原因是大大增加了细胞的生长面积，可一次性扩增获得大量的细胞，但这种方法增加了消化收集细胞和动态观察的难度，需要由技术比较熟练和经验丰富的技术人员实施。脐带间充质干细胞在体外传代扩增是其产业发展和临床研究的关键技术问题，因为没有足够数量的标准化间充质干细胞产品，产业化和临床应用就无从谈起。为此，人们对间充质干细胞体外扩增技术进行了大量研究，开发出一些能够显著提高扩增效率的新技术，其中包括增加细胞贴壁面积的培养技术，例如微载体培养技术、中空纤维培养体系、悬浮培养技术、多空生物材料培养技术等，随着这些技术的发展，间充质干细胞的体外扩增效率还将进一步提高，脐带间充质干细胞将成为标准化、工厂化生产的真正意义上的特殊“新药”。

优化体外分离培养和扩增体系是未来间充质干细胞体外制备技术发展的重要方向，其中包括基础培养基的成分优化和“干性”、促生长因子组合筛选以及新型因子的发现与应用等。培养体系中的动物血清有携带有携带病原生物的风险，特别是一些未知的对人和动物均有感染力的病原，以及现有技术和排除要求难以覆盖的病原等。在脐带间充质干细胞的质量控制标准中，关于病原检测的种类目前尚缺乏统一要求，主要参考输血检测要求进行几种常见病原检测，难以做到排除所有病原。另外，残留血清中的异源蛋白是重要的过敏原，可能对临床应用带来威胁。因此，寻找和利用非动物来源血清及替代物也是未来间充质干细胞制备技术发展的重要方面，一些新型无血清培养基也正在开发利用中。常见的胎牛血清替代物有人脐带血血清、血小板裂解物、蛋白水解产物、细胞因子等。目前存在的问题是间充质干细胞在添加人源血清和血清替代物的培养系统中生长活力相对低且成本较高，研发高效无血清培养技术仍然是所有细胞治疗技术发展必须解决的问题。

1.Bruyn CD，Najar M，Raicevic G，et al. A rapid，simple，and reproducible method for the isolation of mesenchymal stromal cells from Wharton’s jelly without enzymatic treatment. Stem Cells Dev，2011，20（3）：547-557.

2.Wang L，Tran I，Seshareddy K，et al. A comparison of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells and human umbilical cord-derived mesenchymal stromal cells for cartilage tissue engineering. Tissue Eng Part A，2009，15（8）：2259-2266.

3.庞荣清，何洁，李福兵，等.一种简单的人脐带间充质干细胞分离培养方法.中华细胞与干细胞杂志，2011，2（1）：162-167.